Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Как правило, для отделения Ат — Аг* от Аг* используют два метода( хотя можно применять и другие).
Метод разделения на активированном угле, покрытом декст-раном. Активированный уголь обладает широко используемым на практике свойством адсорбировать небольшие молекулы. Адсорбируются также белки и комплекс Ат — Аг*, хотя медленнее и в меньшей степени. Однако если уголь покрыть сшитым полисахаридом декстраном (этот материал является молекулярным ситом, в которое не могут проникать большие молекулы, гл. 8), то ни Ат, ни Ат — Аг* не будут адсорбироваться. Следовательно, если к смеси, содержащей свободный Аг* и Ат — Аг*, прибавить уголь, покрытый декстраном, и смесь немедленно центрифугировать, то радиоактивность, не связанная с Ат (т. е. Аг*), оказывается в гранулах угля, а радиоактивность, отвечающая Ат — Аг*, остается в супернатанте. Схема действия этого быстрого и удобного метода изображена на рис. 10-8, А.
Метод двойного антитела. Обычно антитела получают от кролика. у-Глобулин кролика является антигеном для других жи*
В Am
• Аг*
[j Am + Аг* >?Л декстран
^ Сз
центрифугирование
Только в супернатенте
Ашкр + Аг* — избыток ,
> Аткр Аг*+ Аг*
меньшее количество прибавление Атк
^АтИ[АтКр Аг*] j + Аг*
^центрифугирование
AmK[AmKp Аг*] в осадке Аг* в супернатанте Б
РИС. 10-8.
Методы отделения Ат—Аг* от Аг*.
А — метод с использованием угля, покрытого декстраном (поскольку Аг* является небольшой молекулой, он может проникать в поры декстрановой матрицы); Б — метод двойного антитела. Комплекс Ат—Аг* образует преципитат при добавлении антитела козы. Атк — антитела козы против у-глобулина кролика; Аткр — антитела кролика.
вотных и используется для получения анти-'у-глобулина кролика в организмах козы, барана, лошади и коровы. Добавление к Y-глобулину кролика антисыворотки козы приводит к образованию преципитина, который можно отделить центрифугированием (рис. 10-8, Б). На этом явлении основан следующий прием. К каждой из пробирок, используемых для получения калибровочной кривой, и к пробиркам с образцами (все они предварительно достаточно долго инкубировались для образования Ат — Аг*) прибавляют Ат козы антикролика при точке эквивалентности реакции преципитации (рис. 10-1). Затем смесь инкубируют (обычно в течение 16—48 ч), после чего образец центрифугируют. Ат — Аг* находится в осадке, а свободный Аг* остается в супернатанте. Этот метод дает удовлетворительные результаты, но требует содержания многих животных в качестве источника антисыворотки.
Радиоиммунологический анализ отличается от прочих методов иммунологического анализа тем, что для него требуется радиоактивный антиген. В ряде случаев для этого используют готовые или синтезированные из меченых предшественников 3Н-или 14С-меченые соединения. Чаще применяют иодирование антигена или гаптена 1251 или 1311. Использование 1251 имеет особое преимущество, так как этот изотоп является сильным 7-эмиттером. Как отмечалось в гл. 5, p-эмиттеры считают в жидкостных сцинтилляционных счетчиках, и, поскольку образцы для радио* иммунологического анализа часто содержат значительное количество белка, приходится считаться с проблемой тушения в сцинтилляционной системе. В случае 3Н и 14С тушение может быть достаточно сильным. При использовании ^-эмиттеров тушение проявляется в меньшей степени вследствие высокой энергии радиации.
Получение иодированных антигенов не всегда простая задача, особенно из-за необходимости проводить его таким образом, чтобы вещество не подвергалось риску потерять хотя бы часть своих антигенных свойств. Иодирование белков, аминогрупп или гаптенов, содержащих аминогруппу, можно проводить с применением 1251-3-(4-оксифенил)пропионовой кислоты в виде ее N-оксисукци-нимидного эфира. Для белков, содержащих остатки тирозина, или для гаптенов с фенольными группами подходят различные методы иодирования ароматического кольца. Нуклеиновые кислоты можно иодировать по цитозиновым остаткам.
В некоторых случаях отсутствуют функциональные группы, которые можно было бы иодировать прямым путем; в таких случаях соединение сначала связывают с тирозином или гистамином, после чего иодируют полученный конъюгат.
антиген --- адсорбция D
>¦" ? <1
и выделение 71 промывание <[
специфических _1
? <П антител D
т ИГ •н
