Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Зоны нуклеиновых кислот можно обнаружить в геле различными способами. Радиоактивность обычно измеряют путем разрезания геля, солюбилизации в 0,5 М NaOH или Н2О2 и использования сцинтилляционного счетчика. Если вещество имеет высокую молекулярную массу, то разрезание геля затруднено, поскольку в таких случаях используют очень мягкий гель для достижения большого размера пор. Двухцепочечную ДНК легче обнаружить при окрашивании флуоресцентным красителем бромидом этидия (рис. 9-11), который имеет повышенный квантовый выход (гл. 15) при связывании с нативной ДНК. Краситель Stains-All обладает интересным свойством давать различные окраски с ДНК, РНК и белками.
РИС. 9-12.
Прибор для диск-электрофореза.
Гели полимеризуются в колонке раздельно, после чего их помещают в сосуд с буфером. Иногда верхний гель не используют; в этом случае образец в плотном растворе сахарозы наносят слоем на гель-прокладку, но под буфер. После электрофореза гель извлекают и окрашивают, или, если образец был радиоактивным, разрезают поперек на части и каждый срез анализируют в сцинтил-ляционном счетчике. В некоторых случаях (рис. 9-13) гель разрезают вертикально и анализируют методом авторадиографии. Устройство для пластинок геля (рис. 9-7) может быть использовано также и для диск-электрофореза. 1 — крышка; 2 — образец или область образца; 3 — гель-прокладка; 4 — разделяющий гель; 5 —верхний сосуд; 6 — буфер; 7 — нижний сосуд; 8 — стеклянная трубка.
Диск-электрофорез в полиакриламидном геле
Для достижения максимального разделения используют диск-электрофорез— важное усовершенствование зонального электрофореза. (Как будет видно, термин «диск» относится не к форме полос, получаемых в этом методе, а к тому, что в системе используются неоднородные значения pH, что приводит к прерывистому напряжению.) Метод состоит в том, что первоначальный тонкий слой образца (1—2 мм) концентрируется в сверхтонкую стартовую зону толщиной от 1 до 100 мкм, как показано на рис. 9-12. Заметим, что гель находится в вертикальной колонке и представляет собой три отдельные области: верхнюю, или область образца, среднюю, называемую прокладкой, и нижнюю, состоящую из собственно разделяющего геля. Область образца и гель-прокладка имеют меньшую концентрацию (больший размер пор), чем разделяющий гель, и готовятся в буфере с низкой ионной силой и различными значениями pH. Больший размер пор верхних слоев геля означает, что молекулы в них задерживаются меньше, двигаясь при этом быстрее, чем в нижнем геле. Кроме того, меньшая ионная сила обусловливает большее электрическое сопротивление, поэтому электрическое поле (В/см) в верхнем геле больше, что также приводит к большей скорости движения молекул в верхнем геле по сравнению с нижним гелем. Соотношение значений pH по слоям приводит к такому же влиянию на подвижность. Быстрое движение через верхние слои геля приводит к накопле-
нию вещества на границе между прокладкой и разделяющим гелем. Однако следует заметить, что в геле-прокладке компоненты с близкими подвижностями все же группируются. [Этот процесс называется стэкинг-взаимодействием (stacking), поэтому гель-прокладку иногда называют стэкинг-гелем.] При движении молекул через разделяющий гель образуются различные зоны в соответствии с подвижностями. После окончания разделения гель удаляют из стеклянной трубки. Для идентификации зон существует ряд методов. Гель можно окрашивать путем погружения в раствор красителя с последующим тщательным промыванием для удаления несвязанного красителя. (В некоторых случаях краситель удаляют с помощью электрофореза. Это можно осуществить благодаря тому, что краситель ковалентно связывается с белком, который в свою очередь связан с гелем. Несвязанный краситель свободно выходит из геля при повторном приложении электрического поля.) При необходимости гель можно фотографировать; если же требуется получить количественную информацию, количество связанного геля измеряют с помощью самопишущего денситометра. В другом методе гель разрезают поперек на много слоев, каждый из которых анализируют на радиоактивность, измеряют оптическую плотность при соответствующей длине волны или количество красителя. При использовании радиоактивного материала гель можно разрезать вертикально и анализировать методом авторадиографии.
Диск-электрофорез применяют в основном для определения чистоты предположительно чистых белков и для анализа компонентов смесей, когда необходимо получить очень высокое разрешение (т. е. в случае присутствия очень большого числа компонентов) .
Понятие чистоты, естественно, относительно, и единственная зона может быть результатом того, что примеси присутствуют в слишком малых количествах, чтобы их можно было определить. Поэтому для проверки чистоты используют большие количества белка. Поскольку предел определения вещества при окрашивании составляет около 1 мкг, для гарантированной 99%-ной чистоты следует наносить 100 мкг белка, причем это количество будет достаточным только в том случае, когда вещество в качестве примеси содержит только один белок! Даже при очень высоких концентрациях (0,5—1,0 мг) наличие одной зоны еще не является критерием чистоты, поскольку примеси могут не отделяться в выбранном буфере или при данном pH. Следовательно, для того чтобы иметь хотя бы некоторую уверенность в гомогенности препарата, обычно необходимо использовать несколько буферов и ряд значений pH.
