Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Градиент pH формируется несколько необычным способом. Если создавать его просто диффузией одного буфера в другой при различных значениях pH или смешивать два буфера по мето-
при изоэлектрической
РИС. 9-15.
Процесс миграции фокусировке.
Белки движутся до тех пор, пока они не достигнут такого положения в градиенте pH, когда он» перестают быть заряженными.
"О-
х
Q-
0А т отрицательно & ка заряженные
О А ? незаряженные
ф а щ положительно заряженные
ду, используемому для получения градиентов концентрации (гл. 8), образующийся градиент не будет стабильным в электрическом поле; ионы градиента будут мигрировать в поле, поэтому фракционирование происходить не будет, так как макромолекулы будут двигаться медленнее, чем градиент будет разрушаться. Метод создания стабильного градиента pH состоит в использовании синтетических низкомолекулярных (молекулярная масса 300— 600) полиамфолитов (многозарядных структур), перекрывающих широкий диапазон изоэлектрических точек. Эти полиамфо-литы обычно представляют собой смешанные полимеры алифатических амино- и карбоновых кислот (например, амфолин, LKB Industries, Inc.) Сначала градиент pH устанавливается в дистиллированной воде, где диапазон перекрывания изоэлектрических точек невелик. Перед приложением электрического поля pH во всей системе один и тот же и представляет среднее значение для всех амфолитов в растворе. При приложении поля начинается движение полиамфолитов. Вследствие их собственных буферных
РИС. 9-16.
Устройство для изоэлектрической фокусировки.
Описание его действия приведено в тексте. 1 — фосфорная кислота; 2 — градиенты pH и плотности (амфолит-носитель + сахароза); 3 — электрофокусированные белки; 4 — триэтаноламин*
5 — клапан; 6 — сливной кран.
емкостей постепенно устанавливается градиент pH. После этого каждая частица будет останавливаться в таком самоустанавли-вающемся градиенте в точке, соответствующей ее собственной изоэлектрической точке. Если в смеси содержатся белки с различными изоэлектрическими точками, они будут двигаться до положений, соответствующих их изоэлектрическим точкам до тех пор, пока концентрация и буферная емкость белка (который также является полиамфолитом) не превышают значений, нарушающих градиент pH.
Для этой цели используется устройство, изображенное на рис. 9-16. Градиент pH создается в колонке, охлаждаемой водой, которая изготовлена из стекла и содержит катодную трубку и анод. Колонка заполнена полиамфолитом одной концентрации в градиенте концентрации сахарозы для предотвращения конвекции. Образец также готовится в виде суспензии в полиамфолите. Катодная трубка заполнена сильным основанием (обычно три-зтаноламином), а в верх колонки залита фосфорная кислота, в
Низ Номер фракции Верх
8,7 4,5 3 pH
РИС. 9-17.
Изоэлектрическая фокусировка.
Фермент «УФ-эндо» с помощью различных хроматографических процедур был очищен до несомненной гомогенности. Однако при проверке его методом изоэлактрической фокусировки оказалось, что он состоит из двух белков, каждый из которых обладает ферментативной активностью. Активность фермента определяли по его способности связывать облученную ультрафиолетовыми лучами 3Н-ДНК с нитроцеллюлозой в мембранном фильтре. Обратите внимание» что градиент pH нелинеен. (Любезно предоставил Шейх Риазуддин)
слое которой находится анод. Клапан на дне катодной трубки открывают, после чего к электродам прикладывают напряжение в несколько сот вольт. Полиамфолит вблизи катода будет иметь отрицательный заряд и двигаться по направлению к катоду. Через 1—3 дня система придет в равновесие и белки распределятся в градиенте pH в соответствии с их изоэлектрическими точками. Затем колонку сушат и фракционируют через сливной кран на дне. Различные белки определяются спектрофотометрически, по ферментативной активности или по радиоактивности. Изоэлектрическая фокусировка может применяться как в аналитическом, так и в препаративном вариантах. На рис. 9.17 показана обычно получаемая картина разделения. Метод изоэлектрической фокусировки имеет два больших преимущества: 1) возможно разделение, которое нельзя осуществить другими методами, и 2) белки значительно концентрируются.
Препаративный электрофорез в больших масштабах
Блок-электрофорез
Суспензию гранул крахмала (или стеклянного порошка, силикагеля, целлюлозы, поливинилхлорида или агара) в буфере выливают в большой прямоугольный сосуд, в каждый конец которого вмонтированы электроды. Образец вводят в желобок, получаемый при удалении крахмала вблизи одного из электродов, смешивают раствор белка с крахмалом и закрывают желобок. После электрофореза блок вынимают и элюируют каждую секцию.
Электрофорез на колонках с полиакриламидом
