Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ГЛАВА %J
Электрофорез
Большинство биологических полимеров содержат заряженные группы, поэтому они способны двигаться в электрическом поле. Движение частиц в растворителе под влиянием электрического поля называется электрофорезом.
Скорость перемещения макромолекул в электрическом поле служит их полезной характеристикой. Это свойство можно использовать для определения молекулярной массы белков, для различия макромолекул на основе их общего заряда или формы, для определения изменений в аминокислотном составе при замене заряженной аминокислоты на незаряженную и наоборот, а также для количественного разделения различных видов молекул. Методы, при помощи которых получаются эти результаты, рассматриваются в данной главе.
Теория электрофореза
Подробная теория электрофореза очень сложна и к настоящему моменту еще до конца не разработана. Для понимания принципов использования метода в различных целях достаточно его простого описания.
Во многом электрофорез напоминает седиментацию (гл. 11): к объекту прикладывается сила, которой оказывает сопротивление вязкость среды. Если частица с зарядом q суспендирована в непроводящей среде и находится в электрическом поле ?, она будет двигаться с постоянной скоростью v, определяемой соотношением между электрической силой Eq и сопротивлением вязкой среды fv, где f — коэффициент трения. Отсюда
Eq = fv. (1)
Подвижность и определяется как скорость на единицу поля, или
и — vJE = q/f. (2)
Поскольку подвижность зависит от коэффициента трения, ко-
торый является функцией некоторых физических параметров молекул, в принципе значение и дает информацию о величине и форме молекулы. Однако среда, в которой происходит движение, обычно не изолятор, а электролит, состоящий из заряженных ионов, что вносит дополнительно большие затруднения. Хотя заряженная частица, находящаяся в электролите, притягивает ионы
и поэтому окружена ионной атмосферой, экранирующей ее от приложенного электрического поля, все же эта ионная атмосфера частично нарушается как полем, так и движением частицы сквозь среду. В настоящее время теория элекрофореза не в состоянии точно описать ни эти, ни ряд других процессов, поэтому данные электрофореза не могут трактоваться с точки зрения детальной информации о макромолекулярной структуре. Тем не менее метод находит исключительно широкое применение для аналитических и препаративных целей *, что вызвано его возможностями для разделения различных молекул. Хотя теория может дать общие сведения для выбора условий электрофореза (например, что подвижность увеличивается с ростом q, уменьшается с увеличением/и равна нулю для незаряженных молекул), на практике оптимальные условия почти всегда подбираются эмпирическим путем.
Виды электрофореза
Существует три типа электрофореза: с подвижной границей, зональный и непрерывный.
В электрофорезе с подвижной границей макромолекулы присутствуют во всем объеме раствора, и положение молекул (практически граница, отделяющая растворы от растворителя) как функцию времени определяют с помощью шлиреновской оптики (гл. 11). Этот метод, во многом сходный с граничной седиментацией, является аналитическим методом, использующимся в первую очередь для определения подвижностей и изоэлектрических точек белков, однако в связи с тем, что здесь обычно трудно количественно определить подвижности, метод электрофореза с подвижной границей используется сравнительно редко.
В зональном электрофорезе раствор наносят в виде пятна или полосы, и частицы мигрируют через растворитель, который почти всегда содержится в инертной гомогенной среде, такой, как бумага или гель. Метод используется для анализа смесей, определения чистоты, анализа изменений в подвижности и (или) конформации, а также для очистки. Количественное определение подвижности здесь не проводится, так как практически невозможно
* Часто даются ссылки, для каких целей используется данная методика— для препаративных или аналитических. Препаративная методика разработана для получения относительно больших количеств чистого материала, который может использоваться в дальнейших экспериментах. Аналитическая процедура применяется для контроля чистоты, определения количества компонентов в смеси и, если возможно, оценки их соотношения, обнаружения изменений в заряде и т. д., т. е. дает информацию по отдельным вопросам.
рассчитать ее теоретически с учетом разнообразных эффектов материала носителя.
В непрерывном электрофорезе образец также наносят в виде зоны, за исключением того, что он прибавляется постоянно.
В последующих разделах будут описаны различные методики электрофореза. Электрофорез с подвижной границей рассматриваться не будет, поскольку он используется крайне редко. Информацию об этом методе можно найти в литературе, список которой приведен в конце главы.
Зональный электрофорез
В зональном электрофорезе пятно или тонкий слой раствора, нанесенного на полутвердый или гелеобразный материал, помещают в электрическое поле, в результате чего молекулы перемещаются по или через материал носителя. Поскольку образец наносится в виде зоны, для полноты разделения приходится использовать небольшие количества вещества. В первую очередь функцией носителя является предотвращение механических воздействий и конвекции, которая происходит в результате как температурных изменений, так и высокой плотности концентрированных растворов макромолекул. Однако носитель иногда может адсорбировать молекулы различного типа или действовать в качестве молекулярного сита, приводя тем самым к хроматографическим эффектам (гл. 8), что может или помогать разделению или ухудшать его. Методы использования различных материалов в качестве носителей описаны в следующих разделах.
