Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Выделение специфических клеток животных. Осуществляется с помощью иммобилизованных агглютининов, таких, как конка-навалин А, агглютинина зародыша пшеницы или фитогемагглю-тинина. Например, клетки некоторых опухолей, вызываемых вирусом, можно отделить от нормальных клеток, поскольку клетки опухоли прочнее связываются с конканавалин А-сефарозой.
* Одной из причин, по которой метод не нашел широкого применения для выделения НК, является трудная доступность лигандов — олигонуклеотидов с определенной последовательностью мономеров. Успехи в области синтеза олигонуклеотидов должны резко изменить ситуацию в ближайшее время.— Прим. ред.
Приложение
Очистка фермента:
пример использования многих
хроматографических методик
Следует сказать, что процедуру очистки фермента трудно уместить в нескольких параграфах, тем не менее полезно рассмотреть типичную схему очистки, чтобы понять, каким образом применяются различные хроматографические методы. В качестве примера рассмотрим очистку ДНК-полимеразы I из Е. coli. Метод предложен Паулем Энглундом, который модифицировал первоначальную методику, разработанную в лаборатории Артура Корнберга.
Стадия 1. Разрушение клетки бактерии. Первой стадией почти всегда является разрушение клетки бактерий. Это достигается ультразвуковой обработкой (гл. 18) или последовательным замораживанием — оттаиванием для размягчения клеточной стенки с последующим перемешиванием в миксере с мелкими стеклянными шариками. После разрушения большинства клеток стеклянные шарики, иеразрушившиеся клетки и клеточные стенки лдаляют центрифугированием.
Стадия 2. Частичное удаление нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением сульфата стрептомицина. Вязкость раствора при этом существенно понижается, что позволяет провести концентрирование и удаление нуклеиновых кислот. Эта операция необходима, поскольку нуклеиновые кислоты могут сорбироваться на хроматографических колонках, которые будут использоваться в дальнейшем для разделения белковых компонентов клеток.
Стадия 3. Окончательное удаление нуклеиновых кислот и предварительное удаление некоторых белков автолизом. Для активации нуклеаз к смеси добавляют хлористый магний. После продолжительной инкубации почти все нуклеиновые кислоты распадаются до нуклеотидов и небольших олигонуклеотидов, которые остаются в растворе при осаждении белков на стадии 4.
Стадия 4. Фракционирование сульфатом аммония. Белки имеют различную растворимость в концентрированных растворах солей, поэтому их можно разделять фракционным осаждением при высокой ионной силе. Можно использовать различные соли, однако предпочтение отдается сульфату аммония, поскольку при этом не происходит существенных изменений pH, он недорог, прекрасно растворим и не дестабилизирует белков (гл. 18). Напротив, многие белки становятся стабильными в присутствии иона NH4+. Таким образом, экстракт обрабатывают (NH^SC^ такой концентрации, при которой осаждаются все белки, кроме полимеразы. Осадок удаляют центрифугированием, а к суперна-
танту добавляют избыток (NH4hS04 до достижения концентрации, при которой осаждается полимераза. Этот осадок отделяют и вновь растворяют в буфере, подходящем для проведения стадии 5.
Стадия 5. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Вещество после стадии 4 наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюло-зой при значениях pH и ионной силы, обеспечивающих адсорб-цию на колонке всех нуклеиновых кислот без связывания полимеразы. Эга стадия необходима потому, что небольшие количества нуклеиновых кислот, остающиеся после стадии 4, будут мешать адсорбции на фосфоцеллюлозе на следующей стадии. Свободный объем колонки собирают для использования на стадии 6.
Стадия 6. Хроматография на фосфоцеллюлозе. Хроматография па колонке с фосфоцеллюлозой позволяет отделить большинство других белков от полимеразы. Немногие остающиеся белки удаляются на следующей стадии.
Стадия 7. Гель-проникающая хроматография на сефадексе. Фракции с колонки с фосфоцеллюлозой, содержащие полимеразу, хроматографируют на сефадексе, где разделение происходит по молекулярной массе. Эффективность данной стадии обусловлена более высокой молекулярной массой полимеразы по сравнению с оставшимися белками. Все белки из элюата на стадии 6 отделяются на сефадексе. Фракции, содержащие полимеразу, таким образом, являются чистыми. Затем их обрабатывают (NH4)2S04 для осаждения полимеразы с тем, чтобы сконцентрировать очищенный фермент. Осадок после этого растворяют в малом объеме подходящего буфера.
Список литературы
Bobbit J. М., Schwarting A. Е., Gutter R. I., Introduction to Chromatography, Reinhold, 1968.
Chovin P., Gas Chromatography, in “Comprehensive Biochemistry”, vol. 4, edited by M. Florkin and E. H. Stotz, Elsevier, 1962.
Fisher L., An Introduction to Gel Chromatography, in “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, edited by T. S. Work and E. Work, American Elsevier, 1969.
Helferich F., Ion Exchange, McGraw-Hill, 1962.
