Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Колонки с гистонами на кизельгуре
Гистоны также обладают способностью адсорбироваться на кизельгуре. Поскольку гистоны образуют комплексы только с двухцепочечной ДНК или с РНК, двухцепочечная ДНК может быть очищена этим методом. Нели элюирование проводится путем повышения ионной силы, возможно разделение ДНК в соответствии с составом оснований, причем ДНК с высоким содержанием гуанина и цитозина элюируется в первую очередь.
Хроматография на гидроксиапатите
Гидроксиапатит представляет собой кристаллическую форму Саю(Р04)б(0Н)2, полученную из кристаллов СаНР04*2Н20. Колонки с гидроксиапатитом обладают свойством связывать вещества, взаимодействующие с кальцием, включая ДНК, РНК, ну-клеогистон, поли- и олигонуклеотиды и фосфопротеины. Связывание обеспечивается за счет фосфатных групп в связываемом
Увеличение |РС),|
РИС. 8-27.
Разделение одно- и двухцепочечных ДНК при помощи хроматографии на гидроксиапатите.
Элюирование проводилось в градиенте возрастающей концентрации фосфата
(--------). / — одноцепочечная ДНК;
2 — двухцепочечная ДНК.
Номер фракции
веществе и происходит при низкой концентрации фосфатного буфера, элюирование же осуществляется просто путем повышения его'концентрации. Этот метод имеет серьезное преимущество в случае хроматографии нуклеиновых кислот, заключающееся в малой зависимости поведения вещества на колонке от молекулярной массы. На гидроксиапатите успешно фракционируются следующие смеси: двух- и одноцепочечные ДНК, глюкозилиро-ванная и неглюкозилированная ДНК, различные нуклеогистоны, рибосомная и вирусная РНК, одноцепочечная и двухцепочечная РНК. Пример использования гидроксиапатита приведен на рис. 8-27.
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография использует специфическое сродство между выделяемым веществом и специфически связывающейся с ним молекулой (лигандом). Материал для колонки синтезируется путем ковалентной пришивки молекулы (которая может быть как макромолекулой, так и небольшой молекулой) к нерастворимой матрице. После этого материал в колонке способен адсорбировать из раствора вещество, которое требуется выделить. Элюирование вещества осуществляется в условиях, когда связывание невозможно.
Для успешного проведения аффинной хроматографии следует иметь в виду следующее: 1) матрица должна представлять собой вещество, которое не адсорбирует молекулы в сколько-нибудь заметной степени; 2) лиганд должен присоединяться к матрице без каких-либо изменений связывающих свойств; 3) лиганд должен обеспечивать относительно прочное связывание, поскольку слабое связывание обеспечивает удерживание, но может не привести к полному разделению; 4) условия элюирования не должны приводить к разрушению выделяемого соединения. В качестве матрицы чаще всего используют агарозу (сефароза, Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), поскольку при этом обеспечивается минимальная адсорбция, сохраняются хорошие условия для поддержания скорости тока после связывания с лигандом и существует стабильность при предельных значених pH и ионной силы вплоть до 7,0 М гуанидинийхлорида и мочевины, которые часто бывают необходимы для успешного элюирования. Агароза пригодна для связывания либо с реагентами для аффинной хроматографии белков, мембран и стероидов или с конканавалином А, который является адсорбентом для полисахаридов и гликопротеинов, содержащих a-D-маинозильные и а-°-глюкозильные остатки (например, клеточные мембраны и целые клетки).
Основной областью применения аффинной хроматографии служит очистка белков, мембран и полисахаридов *. Некоторые примеры этого приведены ниже.
Очистка ферментов. Субстрат, представляющий собой прочна связывающий ингибитор или кофактор, можно связать с матрицей. Если смесь белков или даже неочищенный экстракт клеток пропустить через такую колонку, то на колонке останется только то вещество, которое способно связываться. В некоторых случаях ферменты могут быть получены в достаточно чистом виде прямо из очень сложных смесей. Однако зачастую с одним и тем же субстратом или кофактором могут связываться несколько ферментов, поэтому обычно таким методом можно достичь только неполной очистки.
Очистка антител. Осуществляется с помощью сефарозы, активированной бромцианом, к которой присоединяются различные антигены, такие, как белки, вирусы или альбумин бычьей сыворотки, связанные с гаптенами; метод является наилучшим для получения чистых антител.
Очистка транспортных белков. Проводится обычно на сефаро-зе, связанной с веществом, которое должно транспортироваться (например, тироксин-связывающие глобулины, эстрадиол-связы-вающие белки, а также гормональные и лекарственные рецепторы) .
Очистка мембран и частиц, содержащих известные вещества. Мембраны, с которыми связываются гормоны, можно очистить с Использованием сефарозы, на которой иммобилизован гормон; вирус гриппа, содержащий нейраминидазу на поверхности, также можно получить в чистом виде, применив сефарозу со связанным ингибитором нейрамииидазы.
Очистка гликопротеинов. Эффективно применение конканава-лин А-сефарозы.
