Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 76

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 218 >> Следующая

При выборе условий элюирования важно представлять себе, каким образом элюируемая жидкость будет влиять на анализ веществ. Например, при использовании спектрального анализа буфер не должен обладать поглощением в выбранном диапазоне длин волн. Если же образец анализируется по его радиоактивности с использованием счетчика Гейгера, то полезно использовать нелетучие буферы для предотвращения включения радиоактивности в кристаллы, образующиеся в результате высыхания буфера. В случае применения сцинтилляционного счетчика важно, чтобы элюируемая жидкость не содержала примесей, вызывающих тушение.
Приложения ионообменной хроматографии
В принципе на ионообменниках можно хроматографировать любое заряженное вещество. Ионообменные смолы более пригодны для разделения небольших органических молекул и используются даже для разделения ионов металлов (например, для отделения Са2+ от Mg2+). Белки и полисахариды лучше разделяются на ионообменниках на основе целлюлозы, декстрана и полиакриламида. Декстрановые и полиакриламидные ионообменники широко применяются для разделения нуклеотидов, аминокислот и других биологически важных небольших молекул.
Специальные методики в хроматографии нуклеиновых кислот и белков, связывающихся с нуклеиновыми кислотами
Столь сложные молекулы, как белки и нуклеиновые кислоты, обладают таким разнообразием функциональных групп, центров связывания и стабилизирующих сил, что их поведение на стандартных хроматографических материалах трудно даже предсказать. Для них разработаны хроматографические методы, основанные на специфическом взаимодействии молекул.
ДНК-целлюлоза связывает многие белки, которые связываются с ДНК, и можег поэтому использоваться для отделения таких белков от несвязывающихся с ДНК белков или от других веществ. Для получения ДНК-целлюлозы порошок целлюлозы смешивают с раствором одно- или двухцепочечной ДНК и смесь высушивают в вакууме. Затем порошок промывают для удаления несвязанной ДНК и вновь сушат перед хранением. Механизм связывания ДНК с целлюлозой неизвестен. При продолжительном использовании колонки из этого материала приобретают склонность к потере ДНК; для предотвращения этого сухой порошок ДНК-целлюлозы периодически суспендируют в этаноле и
0,15 М 0,80 М 2,0 м
Хроматография на ДНК-целлюлозе
¦
п
/I 11
Клетки E. coli инфицировали фагом T4 в среде, содержащей 14С-лейцин; другую культуру инфицировали фагом Т4, мутантным в гене 32, в среде, содержащей 3Н-лспцин. Белки выделяли, смешивали и наносили на колонку с одноцепочечной ДНК-целлюлозой. Колонку последовательно промывали 0,15, 0,60 и 2,0 М NaCl. Во фракции, соответствующей концентрации 2,0 М, имелся дефицит по 3Н-лейцину, показывающий, что эта фракция содержит меченный 14С белок гена 32. Это было первым успешным применением хроматографии на ДНК-целлюлозе для очистки ДНК-связанных белков. О I4C; • JH. [Alberts В. М., Fed. Ргос., 29, 1154—1175 (1970).]
Пример хроматографии на ДНК-целлю-лозе.
РИС. 8-25.
Номер фракции
подвергают интенсивному облучению ультрафиолетовыми лучами. При этом ДНК ковалентно связывается с целлюлозой.
Хроматография на ДНК-целлюлозе в первую очередь используется для очистки белков, связывающихся с ДНК. Смесь белков и буфере с низкой ионной силой (условия связывания белков с ДНК) пропускают через колонку. Затем колонку промывают для удаления несвязанных белков и элюируют в градиенте возрастания ионной силы. Белки при этом элюируются в порядке увеличения прочности связывания.
Метод впервые был применен Брюсом Альбертсом для обнаружения белков, связывающихся с ДНК, в Е. coli, инфицированной фагом Т4 (рис. 8-25).
В настоящее время этот прием стал стандартной процедурой при очистке полимеров, нуклеаз, репрессоров и т. д. Поскольку используется как одно-, так и двухцепочечная ДНК, существует возможность разделения белков и по степени связывания с каждой из них.
Колонки с метилированным альбумином на кизельгуре (МАК)
Метилированный сывороточный альбумин адсорбируется на кизельгуре (инфузорная земля), прочно связываясь с ним. Джозеф Манделл и Альфред Херши показали, что колонки с таким материалом связывают одно- и двухцепочечную ДНК, причем
РИС. 8-26.
Разделение равных количеств целых и половинных молекул ДНК Т2 с помощью хроматографии на МАК.
Половинные молекулы были получены методом гидродинамического фрагментирования (гл. 18). Элюирование проводили в градиенте возрастания концентрации NaCl. Отметим, что ббльшие молекулы связываются прочнее и для их элюирования необходима более высокая концентрация NaCl. Поскольку все «половины» имеют неодинаковые размеры, зона половинных молекул шире, чем зона целых. 1 — половинные молекулы; 2 — целые молекулы.
оказывается возможным их функционирование при элюировании в градиенте возрастания ионной силы. При использовании различных условий метод эффективен для разделения нативных ДНК по молекулярной массе, составу оснований и степени гли-козилирования; для разделения одно- и двухцепочечных ДНК; для отделения двухцепочечных ДНК с одноцепочечными концами от ДНК без таких концов; для отделения транспортной РНК от ри-босомной РНК; для разделения различных транспортных РНК одна от другой. Пример использования таких колонок приведен на рис. 8-26.
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed