Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Электрофорез на бумаге
На рис. 9-1 показана схема типичного устройства для низковольтного (20 В/см) электрофореза на бумаге. Полоску бумаги сначала погружают в буферный раствор, а затем помещают в камеру, как показано на рисунке. Далее образец наносят либо в виде пятна, либо в виде линии. После окончания разделения бумагу вынимают и высуживают. Если образец содержит достаточное количество вещества, оно1 может быть обнаружено по его окраске, по флуоресценции или при окрашивании различными красителями. Если требуется количественное определение, вещество можно элюировать и определить спектрофотометрически. Так как элюирование красителя редко бывает количественным, точность такого определения составляет около 20%. Если образец радиоактивен, пя гна можно локализовать путем разрезания бумаги и определения радиоактивности (гл. 5) или с помощью авторадиографии целого листа с использованием рентгеновской плен-
РИС. 9-1.
Аппарат для низковольтного электрофореза на бумаге.
Образец наносили на бумагу в виде пятна, как при хроматографии на бумаге (см. рис. 8-G), но обычно близко к середине листа. Бумагу насыщали буфером, после чего оба ее конца погружали в емкости с буфером для осуществления электрического контакта с электродами. Систему закрывали для предотвращения высыхания бумаги. После истечения предварительно определенного времени бумагу вынимали и высушивали. 1 — крышка с ручкой; 2 —бумага; 3 — вода для поддержания влажности; 4 — буфер.
Б
РИС. 9-2.
Два типа аппаратов для высоковольтного электрофореза.
Поскольку более сильный ток вызывает значительное разогревание, способное разрушить образец, бумагу либо погружают в охлаждающую жидкость, либо помещают между двумя охлаждающими пластинами. Заполненный воздухом мешок поддерживает охлаждающие пластины для предотвращения прогибания. А — метод погружения; Ь — метод закрытой бумаги. 1 — охлаждающий змеевик; 2— бумага; 3 — опора; 4 несмешиваю-щаяся охлаждающая жидкость; 5 — буфер; 6 — фитиль; 7 — охлаждающие пластины; 8 — мешок, заполненный воздухом.
ки (гл. 6). В некоторых случаях оказывается полезным прием, заключающийся в комбинации окрашивания с радиоактивной меткой, что позволяет определить, какие вещества являются радиоактивными. Низковольтный электрофорез на бумаге чаще всего используется для анализа смесей белков, которые плохо разделяются хроматографическими методами. Однако этот метод уступает гель-электрофорезу (см. ниже).
Низковольтный электрофорез малоэффективен для небольших молекул (например, аминокислот и нуклеотидов), поскольку из-за малого заряда они обладают низкой подвижностью и, следовательно, медленно делятся. Из-за малого размера молекул имеет место значительное размывание зон за счет диффузии. В высоковольтном электрофорезе скорость разделения увеличивается за счет использования градиента потенциала 200 В/см. Высокое напряжение обусловливает большую силу тока, бумага нагревается, поэтому здесь необходимо охлаждение. Для охлаждения бумагу погружают в большой объем несмешивающейся и не проводящей ток жидкости или прижимают ее к охлаждающей поверхности. Метод погружения (рис. 9-2) используется редко, поскольку применяемые охлаждающие жидкости (например, толуол, четыреххлористый углерод или различные масла) являются токсичными и в ряде случаев огнеопасны. Метод закрытой бумаги, показанный на рис. 9-2, находит более широкое применение. Заметим, что в данном случае бумага не погружается в буфер.
А Б
старт катоЗ анод
РИС. 9-3.
Применение двумерной хроматографии в комбинации с электрофорезом для разделения аминокислот.
Л — только хроматография; Б — хроматография с последующим электрофорезом. Хроматография проведена в системе лутидин—вода (2: 1); электрофорез при pH 2,25. Номерами обозначены следующие пятна: / — триптофан, 2 — тирозин, 3— лейцин, 4 — фенил* аланин, 5 — метионин, 6 — треонин, 7 — оксипролин, 8 — пролин, 9 — аланин, 10 — серии, Н — глутамин, /2 —глицин, 13 — глутаминовая кислота, 14 — аспарагин, /5 —аспарагиновая кислота, 16 — аргинин, 17 — лизин,
После окончания электрофореза бумагу высушивают, и вещества определяют так же, как и при низковольтном электрофорезе.
Высоковольтный электрофорез на бумаге имеет большую ценность для разделения аминокислот и пептидов. Поскольку полное разделение смесей не всегда возможно при использовании одного высоковольтного электрофореза, его часто используют в сочетании с хроматографией; этот метод известен под названием двумерного разделения. Образец вначале подвергают электрофорезу, а затем хроматографируют под прямым углом или наоборот; пример такого разделения приведен на рис. 9.3.
Электрофорез на полосках ацетата целлюлозы
Многие биологические макромолекулы адсорбируются на целлюлозе (т. е. на бумаге) за счет гидроксильных групп целлюлозы. Адсорбция препятствует движению (гл. 9) и поэтому вызывает вытягивание пятен или полос, что ухудшает разделение. Этого можно избежать, если вместо бумаги использовать мембрану из ацетата целлюлозы, так как в нем большинство гидроксильных групп превращено в ацетатные, которые не проявляют адсорбирующих свойств. Помимо того что разделение при этом улучшается, оно также ускоряется, и возможно использовать более низкое напряжение. Меньший размер пятен означает, что вещество в них находится в большей концентрации, поэтому его легче обнаружить. Низкая адсорбция ацетатом целлюлозы приводит к меньшему фону при окрашивании, что увеличивает чувствительность обнаружения.
