Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
К другим достоинствам ацетата целлюлозы следует отнести его прозрачность, дающую возможность определять эти вещества спектрофотометрически, и хорошую растворимость в различных растворителях, что позволяет легко элюировать вещества.
По простоте обращения и степени разделения ацетат целлю* лозы не имеет себе равных. Однако при необходимости получить особо высокое разделение, следует выбрать метод гель-электрофореза.
Гель-электрофорез
Лучшего разделения, в частности, белков и нуклеиновых кислот, можно достигнуть, если в качестве носителя использовать гели крахмала, полиакриламида, агарозы и агарозы — акриламида. Причины этого не совсем ясны, однако такой эффект, очевидно, связан с пониженной диффузией в сетке геля и разделяющим действием гель-проникающей хроматографии (эффект «молекулярного сита»).
РИС. 9-4.
Устройство для электрофореза в крахмальном геле.
Гель образуется на пластинке при набухании зерен крахмала в буфере. Гель надрезают и в этот надрез вводят образец. Систему заливают воском для предотвращения высыханья } _ воск; 2 — образец; <? —крахмальный гель; 4 — проводник из бумаги; 5 — буфер.
старт
РИС. 9-5.
Электрофореграмма при разделении белков в крахмальном геле.
После окончания электрофореза гель окрашивают для обнаружения белков. Заметим, что белки двигаются как к аноду, так и к катоду в зависимости от их заряда.
Первоначально для гель-электрофореза применяли крахмаль-ный гель. На рис. 9.4 изображено типичное устройство для электрофореза в крахмальном геле. Гель представляет собой пасту из картофельного крахмала, зерна которого разрушены нагреванием в буфере. При горизонтальном положении геля, как показано на рисунке, образец наносится в щель, прорезанную лезвием бритвы, в виде раствора или смеси с зернами крахмала. Щель заливают воском или жиром, после чего прикладывают напряжение. После окончания электрофореза полутвердый гель отделяют и часто разрезают на два или три слоя, каждый из которых окрашивается различным способом. Разнообразные компоненты проявляются в геле в виде серии полос (рис. 9-5). В настоящее время крахмальный гель используется редко, поскольку более удобным оказался полиакриламидный гель.
Полиакриламидный гель заменил крахмальный гель потому, что при его использовании можно контролировать эффект молекулярного сита с помощью изменения концентрации геля, а адсорбция белков в нем весьма мала. Полиакриламид — наиболее эффективный носитель для электрофореза белков и небольших молекул РНК. (Для нуклеиновых кислот, размер молекул которых больше размера пор полиакриламида, лучше использовать агарозу или агарозу — акриламид.) Полиакриламидный гель получается при сшивании акриламида Ы,Ы'-метилен-бис-акрила-
РИС. 9-6.
Прибор для гель-электрофореза на колонке.
Гель полимеризуетея непосредственно в колонке, которую потом соединяют с сосудами с буфером. Образец суспендируют в концентрированном растворе сахарозы и наносят на поверхность геля в виде тонкого слоя с помощью пипетки. После окончания электрофореза гель извлекают из колонки и затем либо окрашивают для обнаружения зон, либо (при использовании радиоактивного образца) разрезают на поперечные части и измеряют радиоактивность в каждом таком срезе, / — образец;
2 — буфер; 3 — гель.
?
щ— ' —fgjj
!
РИС. 9-7.
Прибор для электрофореза на пластинках геля, позволяющий проводить одновременный анализ семи образцов.
Гель полимеризуетея непосредственно в рабочей емкости. Обычно при полимеризации но верхнему краю геля формируются углубления для нанесения образцов. После электрофореза пластинку окрашивают либо при добавлении красителя в верхний буфер, либо погружением геля в раствор красителя после удаления пластинки из рамки. Избыток красителя удаляют либо промыванием, либо электрофорезом. А — вид спереди; Б — вид сбоку, / — буфер; 2 — образцы; 3 — гель; 4 — образец; 5 — пластмассовая рамка.
мидом непосредственно в контейнере, предназначенном для проведения электрофореза.
Электрофорез в полиакриламидном геле проводят или в колонках с гелем, или на пластинках геля (рис. 9.6 и 9.7). В последнее время колонки быстро вытесняются пластинками геля, использование которых позволяет одновременно на одной пластинке анализировать большое число образцов.
Электрофорез в полиакриламидном геле, вероятно, является наиболее гибкой и используемой электрофоретической системой
РИС. 9-8.
Электрофорез белков в ДСН.
Разрушенный вирус полиомы (слева) и белок капси-да вируса полиомы (справа) обрабатывали ДСН и меркаптоэтанолом, после чего раздельно анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Для обнаружения белков гели окрашивали. Зоны, идентифицированные как Гистоны (две верхние зоны), обнаружены только в целом вирусе. Поскольку вирус содержит РНК, этот факт использован для доказательства того, что клеточные гистоны связаны с вирусной РНК. (Любезно предоставил Вильям Мураками.)
для анализа и разделения макромолекул. Для специальных целей разработаны два варианта, описанные ниже.
ДСН-гель-электрофорез. Клаус Вебер и Мери Осборн показали, что молекулярную массу многих белков можно определить с помощью измерения их подвижности в полиакриламидном геле, содержащем детергент — додецилсульфат натрия (ДСН). При нейтральном pH в 1%-ном ДСН и 0,1 М меркаптоэтаноле большинство многоцепочечных белков связывает ДСН и диссоциирует, дисульфидные связи разрываются меркаптоэтанолом, вторичная структура исчезает, в результате чего комплексы, состоящие пз субъединиц белка и ДСН, приобретают беспорядочную конфигурацию. Обработанные таким образом белки имеют одну и ту же форму и одинаковое отношение заряд/масса. Это объясняется тем, что количество ДСН, связываемое на единицу массы белка, всегда постоянно и равно 1,4 г ДСН на 1 г белка; таким образом, заряд в большей степени определяется ДСН, чем различными зарядами, присущими аминокислотам. Таким образом достига-
