Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Следующий пример иллюстрирует использование диск-электрофореза для разделения сложной смеси.
РИС. 9-13.
Электрофореграмма белков, синтезируемых ?. coli при заражении диким (W) фагом Т4 или мутантным (В270) фагом в главном белке
головки.
Зараженные клетки метили 3Н-лейцином в течение 10—12 мин после инфекции. Затем белки экстрагировали и подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле, содержащем щелочную мочевину. После электрофореза гель разрезали вертикально и авто-радиографировали. Заметим, что зона 22 (главный белок головки) отсутствует в случае терминирующего цепи мутанта В270, а взамен появляется новая зона (Ат), соответствующая образующемуся фрагменту [Hosoda 1., Levinthal С., Virology, 34, 709—716 (1968)].
Пример 9-А. Анализ белков, образующихся при заражении бактерии Е. coli фагом Т4. Если ?. coli инфицировать фагом Т4, то это приведет к синтезу большого числа белков-медиаторов фага. Относительное количество каждого из них и протекание во времени его синтеза можно изучить с помощью диск-электрофо-реза, используя для обнаружения белка радиоактивную метку. Если смесь всех белков, содержащихся в инфицированной клетке, подвергнуть электрофорезу и затем окрашиванию, гель окажется окрашенным практически равномерно, поскольку в нем будут присутствовать тысячи белков. Однако инфицирование фагом Т4 приводит к прекращению синтеза белков клетки-хозяина, поэтому, если заражение проводить в присутствии 3Н-лейцина, бактериальные белки не будут радиоактивными. Таким образом, для изучения синтеза белков при заражении фагом Т4 нужно добавлять 3Н-лейцин через различные промежутки времени после заражения и отделять клетки через несколько минут после каждого добавления 3Н-лейцина. Затем белки выделяют и разделяют с помощью диск-электрофореза, а зоны обнаруживают с помощью авторадиографии. При этом можно заметить, что в разное время образуются различные зоны.
При заражении мутантным фагом, который вызывает синтез только фрагмента изучаемого белка, одна зона исчезает, а вместо нее появляется другая, соответствующая фрагменту (рис.
РИС. 9-14.
Прибор для проточного электрофореза.
Образец наносят непрерывно, как показано на схеме, причем буфер течет вертикально вниз по бумаге и капает в пробирки коллектора. Потенциал приложен перпендикулярно направлению тока буфера. 1 — образец; 2— бумага, пропитанная буфером; 3 —резервуар с буфером.
9-13). Следовательно, исчезающая зона соответствует гену* который претерпел мутацию. При использовании множества таких мутаций можно идентифицировать каждую зону; таким об-разом определяют последовательность синтеза различных белков. Следует особенно подчеркнуть, что такой анализ проводится в присутствии всех бактериальных белков, однако они не являются помехой, поскольку не включают радиоактивную метку.
Непрерывный (проточный) электрофорез
Непрерывный электрофорез представляет собой препаративный метод, заключающийся в одновременном перемещении непрерывно прибавляемого вещества в одном направлении потоком растворителя и в другом направлении — электрическим полем. В качестве носителя здесь часто используют фильтровальную бумагу,, однако можно проводить проточный электрофорез и без целлюлозного носителя. Схема метода показана на рис. 9.14. Большой лист бумаги, расположенный, как показано на рисунке, помещают в камеру из плексигласа. Верхний край бумаги погружают в. резервуар с буфером, причем первоначально всю бумагу смачивают буфером. Пока резервуар полон, буфер непрерывно движется по бумаге вниз под действием капиллярных сил и капает с зубцов на нижнем крае в пробирки. Вдоль линии старта непрерывна прибавляется разделяемый раствор с помощью механического шприца или фитиля. Электрическое поле приводит к постоянному горизонтальному перемещению, степень которого зависит от
степени и знака подвижности. Разделение определяется такими факторами, как скорость тока буфера, скорость прибавления вещества, приложенное напряжение, pH и ионный состав буфера; оптимальные условия обычно подбирают опытным путем. Такая система успешно применяется для разделения белков, пептидов, аминокислот, других небольших молекул и неорганических ионов.
При работе с некоторыми веществами приходится сталкиваться с проблемой адсорбции на бумаге. Во избежание этого Курт Хэннинг разработал систему, в которой не требуется целлюлозный носитель. Для этого буфер из резервуара постоянно течет между двумя очень близко расположенными стеклянными пластинами. Точность температурного контроля и малое расстояние между пластинами, обусловливающее значительную капиллярность, понижают конвекцию. Ряд конических отверстий у основания позволяет собирать различные фракции. Этот дорогой и сложный прибор не нашел широкого применения, однако он дает прекрасное разделение белков, пептидов и различных кровяных клеток (например, лимфоциты человека, вырабатывающие антитела, можно отделить от лейкоцитов и макрофагов).
Изоэлектрическая фокусировка
Белки являются амфолитами, т. е. они содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы. Для всех амфолитов характерна зависимость их заряда от pH: при низких pH они заряжены положительно, а при высоких — отрицательно. Для каждого амфолита существует такое значение pH, при котором он является незаряженным; это значение называется изоэлектри-ческой точкой. В изоэлектрической точке амфолит не движется в электрическом поле. В градиенте pH молекулы белка будут перемещаться до тех пор, пока не достигнут точки градиента, где они становятся незаряженными; после этого они перестают двигаться. В случае смеси белков каждый белок будет перемещаться до точки градиента pH, соответствующей его собственной изоэлектрической точке. Такой метод разделения белков, основанный на различиях изоэлектрических точек в градиенте pH, называется изоэлектрической фокусировкой и является электрофоретическим аналогом центрифугирования с достижением равновесия в градиенте плотности (гл. 11). Процесс движения двух различных белков с отличающимися изоэлектрическими точками схематически показан на рис. 9-15.
