Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Ingram V. M.t Abnormal Human Haemoglobins. 1. The Comparison of Normal Human and Sickle-Cell Haemoglobins by “Fingerprinting”, Biochim. Biophys. Acta, 28, 539—545 (1959). Развитие метода «отпечатков пальцев».
Mandell J. DHershey A. D., A Fractionating Column for Analysis of Nucleic Acids, Analyt. Biochem., 1, 66—77 (1960). Первое описание хроматографии на МАК-
Martin А. L РSynge R. L. М., A New Form of Chromatography Employing Two Liquid Phases, Biochem. J., 35, 1358—1368 (1941). В этой статье впервые описана распределительная хроматография.
Peterson Е. A., Cellulosic Ion Exchangers, in “Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology , vol. 2, edited by Г. S. Work and E. Work, North-Holland, 1970, pp- 228—400.
Purnell H., Gas Chromatography, Wiley, 1962.
Randerath K-, Thin-Layer Chromatography, Academic Press, 1966.
Хорошим источником информации могут служить брошюры, выпускаемые фирмами Pharmacia Fine Chemicals, Inc. and Bio-Rad Laboratories. Самую новую информацию можно найти в журналах Chromatorgaphy Journal of Chromatography and Journal of Gas Chromatography.
Задачи
8-1. Предположим, что фермент диссоциирует на четыре идентичные субъединицы и вы хотите проверить ферментативную активность индивидуальных субъединиц, но при этом следует быть уверенным в том, что в образце не остается тетрамера. Какую хроматографическую систему вы выберете, чтобы отделить мономеры от тетрамера?
8-2. При попытке очистить белок было обнаружено, что белок прочно связывается с ДНК- При прибавлении ДНКазы для разрушения ДНК оказалось, что ДНКаза связывается в комплекс без разрушения ДНК. Поэтому для удаления ДНК ДНКазу использовать нельзя. Для диссоциации комплекса ДНК — белок необходим 2 М NaCl; при такой концентрации соли ни ДНК, ни белок не удерживаются ионообменнпком. Каким образом можно очистить этот белок?
8-3. При получении гибридной ДНК путем ренатурании денатурированном ДНК обычно имеется некоторое количество неренатурированной ДНК. Каким образом можно его удалить?
8-4. Имеются две молекулы ДНК, молекулярная масса которых равна 6-106, причем одна из них кольцевая, а другая — линейная. Какая молекула будет элюироваться первой с колонки с агарозой? Что можно сказать о нативной и денатурированной рибосомных РНК? (Рибосомная РНК имеет выраженную вторичную структуру.)
8-5. Методика очистки данного фермента предусматривает использование гель-проникающей хроматографии. Пытаясь увеличить количество получаемого вещества, вы используете образец с концентрацией в 10 раз большей, чем обычно применяется в этой методике. Основная часть ферментативной активности при этом элюируется в холостом объеме. Объясните, что произошло?
Будет ли, как правило, необходимым увеличивать диаметр колонки при увеличении количества наносимого вещества? Будет ли увеличиваться длина колонки? Нужно ли увеличивать оба размера?
8-6. При хроматографии на бумаге вещества А, Б, В и Г в различных
системах растворителей имеют следующие значения К/:
Бутанол---Н20 Изопропанол---НС1 Этанол Уксусная кислота
А 0,23 0,31 0,42 0,09
Б 0,24 0,20 0,51 0,62
В 0,38 0,58 0,40 0,64
Г 0,41 0,56 0,53 0,10
Укажите наилучший способ разделения веществ А — Г.
8-7. Смссь белков (20 мг) нанесли на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Известно, что 30% белка составляет фермент X. После элюирования колонки общее количество белка во всех фракциях составило 18,9 мг. При этом не
было обнаружено активности, отвечающей ферменту X. Объясните по возможности потерю ферментативной активности.
8-8. Молекула ДНК с молекулярной массой двухцепочечной части 6*10® дальтон и одноцепочечным участком с длиной, равной двухцепочечной части, адсорбируется на гидроксиапатите. Принимая во внимание, что в этих пределах хроматографическое поведение мало зависит от молекулярной массы, что можно ожидать при промывании колонки с возрастающим градиентом концентрации Р043_, т. е. будет ли молекула элюироваться в одноцепочечном или в двухцепочечном диапазоне концентрации или где-нибудь в другом месте?
8-9. Известно, что фермент проявляет активность в присутствии высокой концентрации ионов Mg2+. При удалении ионов магния белок необратимо денатурирует. Предположим, что в принятой схеме очистки вы должны применить как ионообменную, так и гель-проникающую хроматографию, причем в обоих случаях фермент теряет активность. Объясните, в результате чего это могло произойти. Какую модификацию, с вашей точки зрения, следует применить, чтобы исправить положение?
8-10. Некоторые лекарственные вещества, такие, как морфин, связываются со специфическими рецепторами в нервных тканях. Предложите методику частичной очистки этих рецепторов.
8-11. Два белка имеют одинаковые молекулярные веса. При pH 5,5 оба они обладают выраженной вторичной структурой, имея при этом по меньшей мере 75% а-спиралей. При pH 8,5 один из них теряет структуру, полностью переходя в беспорядочную спираль; при pH 5,5 его структура вновь образуется. Опишите методику разделения этих белков.
