Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Для этой процедуры применяется аппарат, показанный на рис. 9—18. Вещество постоянно стекает в элюирующий буфер, который проходит через колонку, как показано на рисунке. Элюирующий буфер собирают с помощью коллектора фракций.
Иммуноэлектрофорез
Как отмечалось выше в этой главе, вещества с одинаковой подвижностью часто можно разделить с помощью последующей хроматографии в перпендикулярном направлении или хроматографией с последующим электрофорезом (рис. 9-3). Такое разделение включает две стадии. Иммуноэлектрофорез также состоит из двух стадий: вещества сначала разделяются методом электрофореза, а затем обнаруживаются с помощью иммунодиффузии (гл. 10).
Иммуноэлектрофорез обычно проводят на горизонтальных пластинках агара или агарозы, как показано на рис. 9-19. Для этого готовят однородный слой и в нем делают ямку и желобок, в которые помещают антиген и антитело соответственно. Смесь антигенов помещают в ямку, после чего пластинку подвергают электрофорезу, во время которого молекулы движутся в обоих направлениях, причем проходимые расстояния зависят от их подвижностей и знака заряда. После окончания электрофореза в желобок вносят антисыворотку. Антисыворотка и антигены диффундируют через гель. Если при их встрече происходит реакция антиген — антитело, образуется видимая искривленная пре-ципитиновая линия (рис. 9-19, В и гл. 10). Этот метод позволяет идентифицировать ряд антигенов, вызывающих образование антител, и относительное количество каждого, причем возможно
РИС. 9-18.
Прибор для препаративного диск-электрофореза для разделения больших количеств. Для сравнения см. рис. 9-12.
/ — буфер; 2 —образец; 3 — гель-прокладка; 4 — разделяющий гель; 5 — элюирующий буфер; 6 — к коллектору фракций.
/
В
РИС. 9-19.
Проведение иммуноэлектрофореза.
А— лунка заполняется белком; Б — электрофорез приводит к движению белков. Затем ток отключают и в желобок добавляют антисыворотку; В — иммунодиффузия приводит к образованию преципитиновых линий. 1 — предметное стекло микроскопа; 2 — лунка, заполненная антигеном; 3—желобок для смеси антител; 4— полоска фильтровальной бумаги, насыщенная буфером; 5 — агаровый гель; 6 — антисыворотка.
РИС. 9-20.
Использование иммуноэлектрофореза для анализа чистоты экзонуклеазы фага X Е. coli.
Относительно очищенная фракция X экзонуклеазы (А) и более тщательно очищенная фракция (Б) анализировались следующим образом. Делали четыре ямки и заполняли их белком: две слева — фракцией А, а две справа — фракцией Ь. Систему подвергали электрофорезу таким образом, что движение происходило вверх в плоскости рисунка. Внешние полоски, соответствующие ямкам 1 и 4, разрезали перпендикулярно направлению движения. Каждый срез элюировали и анализировали на эндонуклеазную активность. На графиках показана активность в срезах как функция положения. Центральный желобок был заполнен аитисывороткой, направленной против частично очищенной эндо* нуклеазы, после чего проводили иммунодиффузию (гл. 10). Заметим, что во фракции А главная преципитиновая зона не совпаадет по положению с активностью; в этом месте находится только очень слабая полоса (указана стрелкой). Следовательно, в ферменте имеется основная примесь. Во фракции Б более тщательная очистка приводит к исчезновению зоны примеси и видна только одна полоса в надлежащем месте. Следовательно, этот белок является чистым [Radding С. M.t Shreffler D. С., J. Mol. Biol., 18, 251—261 <1966)].
анализировать материал, для которого пригоден только метод иммунологического анализа (например, перекрестно-реагирую-щие неактивные фрагменты ферментов) (рис. 9-20).
Список литературы
DeWachter R., Fiers W., Fractionation of RNA by Electrophoresis on Polyacrylamide Gel Slabs, in “Methods in Enzyrnology”, vol. 21, edited by L. Grossman and K. Moldave, Academic Press, 1971, pp. 167—178.
Efron М., High Voltage Paper Electrophoresis, in “Cromatographic and Electrophoretic Techniques”, vol. 2, edited by I. Smith, Interscience, 1960, pp. 158—189.
Gordon Л. H., Electrophoresis of Proteins in Polyacrylamide and Starch Gels, in “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, vol. 1, edited by T. S. Work and E. Work, North-Holland, 1968, pp. 1—149.
Maurer H. R., Disc Electrophoresis, deGruyter, 1971.
Ornstein L., Disc Electrophoresis, Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 321—349 (1964).
Raymond S.t Acrylamide Gel Electrophoresis, Ann. N. Y. Acad. Sci., 121* 350—365 (1964).
Smithies O., Zone Electrophoresis in Starch Gels: Group Variations in the Serum Proteins of Normal Human Adults, Biochem. J., 61, 629—641 (1953).
Первое описание использования гелей крахмала.
Weber К., Ocborn М., The Reliability of Molecular Weight Determined by Do-decyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, J. Biol. Chem., 244, 4406—4412 (1969). В статье изложены основные принципы ДСН-гель-электрофореза.
Zwaan J.y Estimation of Molecular Weights by Polyacrylamide Gel Electro-phoresis, Analyt. Biochem., 21, 155—168 (1967).
