Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 75

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 218 >> Следующая

Выбор пористости и ситового размера
Небольшие молекулы лучше разделяются на матрицах с малым размером пор (с высокой степенью сшивания), поскольку для них реальная емкость сорбента достаточно велика, тогда как для разделения макромолекул необходимы сорбенты с большими размерами пор. Однако большинство ионообменников, за исключением сефадекса, не обладают заметной зависимостью между пористостью и молекулярной массой разделяемых веществ*.
Ионообменники на основе целлюлозы являются наилучшими для очистки больших молекул, таких, как белки и полинуклеоти-
* Следует отметить, что все сорбенты на основе стирола и дивинилбен-зола отвечают вышеизложенному.
ды, поскольку из-за волокнистой структуры матрицы все функциональные группы находятся на поверхности и доступны даже для самых крупных молекул.
Выбор ситового (меш) размера, как правило, представляет трудность. Малый размер частиц обычно улучшает разделение, но приводит одновременно к замедлению скорости тока, а это в свою очередь вызывает увеличение размывания зон и ухудшение разрешения. Поэтому оптимальный ситовый размер чаще всего приходится подбирать эмпирическим путем.
Выбор pH, буферов и ионных условий
Так как буферы сами по себе состоят из ионов, они также принимают участие в ионном обмене, в результате чего равновесие pH может изменяться. Для решения этой проблемы принято правило: катионные буферы используются с анионитами, а анионные буферы — с катионитами. Поскольку связывание зависит от ионной силы, выбранный буфер должен иметь большую буферную емкость, но при этом ионная сила не должна быть слишком высокой. Более того, для улучшения разрешения принято использовать для элюирования ионные условия, близкие к тем, которые были в образце при нанесении его на колонку (так называемые стартовые условия).
Методика ионообменной хроматографии
Принципиальной основой ионообменной хроматографии является то, что сродство вещества к ионообменнику зависит от электрических свойств его самого и относительного сродства других заряженных веществ, находящихся в растворителе. Следовательно, связанное вещество можно элюировать с помощью изменения pH до значения, изменяющего заряд вещества, или добавлением конкурирующего вещества, одним из примеров которого могут служить соли. Поскольку различные вещества обладают разными электрическими свойствами, условия элюирования будут меняться для каждого вида связанных молекул. В общем, для получения хорошего разделения следует выбрать либо непрерывное элюирование в градиенте ионной силы, либо ступенчатое элюирование. (Градиент только pH не используют по причине трудности создания его без одновременного увеличения ионной силы.) При хроматографии на анионитах постоянно повышают либо pH и ионную силу, либо только ионную силу элюента. Хроматографию же на катионитах проводят как в градиенте pH, так и в градиенте ионной силы элюирующего буфера. На практике выбор условий элюирования проводится методом проб и ошибок с учетом условий стабильности анализируемого вещества. Напри-
РИС. 8-23.
Разделение четырех белков при помощи ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.
Обратите внимание на сильную зависимость от вида градиента NaCl. На графике А более крутой градиент позволяет достигнуть только частичного разделения на две фракции. При более пологом градиенте на графике Б белки II и III явно разделяются, а присутствие белков I и IV становится очевидным.
РИС. 8-24.
Разделение нуклеозидов РНК путем хроматографии на дауэксе-50\\МХ.
Образец, представляющий собой гидролизат РНК, обработанной щелочной фосфатазой для удаления концевых фосфатных групп, наносили на колонку и элюировали 0,4 М формиатом аммония при pH 4. Для определения количества каждого вещества измеряли поглощение, поскольку соотношение между значением поглощения при 260 нм и концентрацией известно. / — уридин; 2~ гуанозин; 3— аденозин; 4 —цитозин.
мер, при хроматографии нестабильных соединений желательно соблюдать постоянное значение pH. Типичная ионообменная хроматограмма при градиентном элюировании показана на рис. 8-23.
Для разделения очень схожих веществ элюирование можно проводить без изменений pH или ионной силы. Например, предположим, что ионные условия выбраны таким образом, что связывание молекулы со многими центрами связывания настолько
слабо, что существует определенная вероятность диссоциации всех связей в течение заданного времени. Таким образом, молекула находится с ионообменником в равновесии и будет перемещаться по колонке с определенной скоростью. Скорость движения будет соответствовать вероятности диссоциации, поэтому молекулы с мало отличающимся сродством к ионообменнику будут двигаться по колонке с различной скоростью, т. е. произойдет их разделение. (Формально в данном случае это эквивалентно адсорбционной хроматографии.) Простой вариант этого метода носит название метода стартовых условий и заключается в том, что образец адсорбируется и элюируется в одном и том же растворителе. В общем, разрешение улучшается, если скорость тока очень мала, однако с уменьшением скорости тока появляется проблема диффузионного размывания, в результате которого разрешение может ухудшаться. Оптимальная скорость тока обычно определяется эмпирически. На рис. 8-24 изображена типичная хроматограмма, полученная методом стартовых условий.
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed