Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 91

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 218 >> Следующая

Анализ по фиксации комплемента основан на свойстве комплемента связываться комплексом антиген — антитело, в резуль-
РИС. 10-3.
Фиксация комплемента.
Для наглядности здесь приведены эквивалентные количества антитела и антигена и из* быток комплемента. Обычно количества антигена п антитела выбирают так, чтобы комплемент связывался при эквивалентности. Эритроциты барана предварительно покрываются антителами кролика к эритроцитам барана; на рисунке это опущено. А — свободный комплекс связывается с эритроцитами, подвергая их лизису. / — выделившийся гемоглобин; 2—гемоглобин в супернатанте определяется измерением оптического поглощения.
тате чего остается меньшее количество комплемента. При наличии антигена к некоторым элементам поверхности эритроцитов добавление комплемента приводит к лизису (разрыв клеток). В случае эритроцитов лизис хорошо виден: если интактные (целые) клетки центрифугировать, красный пигмент гемоглобин оказывается на дне центрифужной пробирки; при наличии лизиса (в данном случае гемолиза) гемоглобин остается в супернатанте, причем его количество можно определить по поглощению при 541 нм (гл. 14). В стандартном тесте используется сыворотка морской свинки в качестве источника комплемента, эритроциты барана и антитела кролика к эритроцитам барана. Анализ обычно проводится в две стадии (рис. 10-3):
1. Антиген, антитело и измеренное количество комплемента смешивают и инкубируют до полного связывания комплемента.
РИС. 10-4.
Калибровочная кривая фиксации комплемента.
К постоянным количествам антнтела и комплемента прибавляют различные количества антигена. После инкубации добавляют эритроциты барана и антитела против эритроцитов барана. После второй инкубации смесь центрифугируют для удаления оставшихся целыми эритроцитов. Количество выделившегося гемоглобина определяют по поглощению супернатанта. Если комплемент не фиксируется, то в супернатанте присутствует максимальное количество гемоглобина. Заметим, что два различных количества антигена могут приводить к фиксации одного и того же количества комплемента. Для измерения количества антигена при неизвестной концентрации необходимо проводить определения с разбавлениями образца. Если при разбавлении антигена количество фиксируемого комплемента уменьшается, фиксируемое количество соответствует участку кривой, отвечающему избытку антитела.
На этой стадии комплемент фиксируется комплексом антиген — антитело.
2. Затем к смеси добавляют эритроциты барана, предварительно покрытые специфическим антителом кролика. На этой сда-дии комплекс эритроцит—антитело связывает комплемент, который не был поглощен на стадии 1. После инкубирования, во время которого протекает лизис, смесь центрифугируют, а затем измеряют оптическую плотность супернатанта.
Так как для гемолиза требуется свободный комплемент (т. е. тот, который не поглотился при первой реакции антиген — антитело), количество гемоглобина в супернатанте измеряется по количеству оставшегося комплемента. Заметим, что увеличение реакции антиген — антитело означает уменьшение лизиса.
Фиксацию комплемента можно использовать для измерения количества данного антигена, находящегося в сложной смеси, причем с высокой чувствительностью. На рис. 10-4 изображена зависимость количества фиксированного комплемента (иными словами, уменьшения лизиса) от количества добавленного антигена в присутствии определенного количества антитела. Обычно количество фиксируемого комплемента увеличивается с повышением количества антигена при избытке антитела и уменьшается при избытке антигена. Следовательно, для измерения количества данного антигена требуется придерживаться стандартной после-
довательности. Во-первых, получают калибровочную кривую, такую, как показана на рис. 10-4, используя заведомо известные количества антигена. Затем проводят реакцию при нескольких разбавлениях образца антигена. Это необходимо для того, чтобы выяснить, соответствует ли количество фиксируемого комплемента ветви кривой, отвечающей избытку антигена или избытку антитела. После этого по кривой можно определять количество антигена.
Метод фиксации комплемента обычно в 50—100 раз более чувствителен, чем реакция преципитации. Он дает возможность в ряде случаев определять до 0,01 мкг некоторых антигенов. Главным его недостатком является то, что в некоторых смесях, используемых для анализа с целью определения антигена, могут присутствовать вещества, инактивирующие комплемент (анти-комплементарные вещества) или стимулирующие протекание гемолиза.
Торможение фиксации комплемента и пассивная агглютинация
Многие вещества могут быть определены по их способности ингибировать реакции антиген — антитело. Это особенно широко используется при анализе гаптенов, поскольку гаптены обычно реагируют с антителом без фиксации комплемента. Поэтому прямое определение гаптенов по фиксации комплемента невозможно. Однако, если реакция антиген — антитело проводится таким образом, что все антитела полностью связываются антигеном и весь комплемент фиксирован, любой агент, который может связывать антитело без фиксации комплемента, можно определить по восстановлению количества фиксированного комплемента. Таким образом, если с антигеном добавляется гаптен, дающий перекрестную реакцию, этот гаптен может конкурировать с антигеном за центр связывания антигена с антителом и, следовательно, снижать количество фиксируемого комплемента. Путем прибавления различных количеств данного гаптена к данной смеси антиген-антитело можно получить калибровочную кривую, которую затем можно использовать для определения неизвестного количества того же гаптена в смеси. Эта процедура называется тестом торможения фиксации комплемента. Пример показан на рис. 10-5.
Предыдущая << 1 .. 85 86 87 88 89 90 < 91 > 92 93 94 95 96 97 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed