Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
факта, что даже после образования преципитина его количество зависит от изменения соотношения антиген — антитело. В условиях избытка антитела и эквивалентности антиген преципитиру-ется полностью; таким образом, преципитация избытком антитела может быть использована для удаления из раствора некоторых веществ. Например, для определения количества конкретного белка (назовем его А) к смеси радиоактивных белков можно прибавить анти-А и отделить преципитат центрифугированием. Соотношение общей и осаждаемой радиоактивности дает возможность установить количество белка А в смеси белков. О значении реакции преципитации в радиоиммунологическом анализе речь пойдет ниже.
Гель-диффузионные реакции преципитации
и иммунодиффузия
Реакция преципитации может проводиться в агаровом геле. Схематически этот метод изображен на рис. 10-2, А. Пробирку частично заполняют агаром, содержащим антисыворотку, а сверху наносят антиген. Антиген диффундирует в агар с образованием движущегося фронта образования преципитата. В данном случае преципитат представляет собой зону вследствие обратимости реакции преципитации, о чем упоминалось в предыдущем разделе. Таким образом, в верхней части пробирки из-за избытка антигена наблюдается небольшое количество преципитина (рис. 10-1). При продолжающейся диффузии антигена зона преципитата перемещается. Это происходит потому, что в передней части зоны преимущественно содержится антитело, тогда как в задней имеется избыток антигена; избыток антигена растворяет преципитат (рис. 10-1). Если и антиген, и антитело представляют собой смеси некоторых реагирующих веществ, то в результате будет наблюдаться несколько зон, предположительно по одной на каждый комплекс антиген — антитело. Разделение этих зон зависит от коэффициентов диффузии антигенов и относительных концентраций антигенов и антител; таким образом, если два антигена имеют однаковые коэффициенты диффузии, а концентрации антигенов п антител также одинаковы, то в результате будет наблюдаться только одна зона. Число наблюдаемых зон всегда представляет минимальное значение числа присутствующих антигенов.
Дополнительная информация может быть получена с помощью метода двойной диффузии (метод Ухтерлони), схематически изображенного на рис. 10-2, Б—Г. В агаровом геле, находящемся в чашке Петри, делают три лунки, две из которых заполняют антигеном, а третью — антисывороткой. Из каждой лунки по всем направлениям происходит диффузия. При достижении
РИС. Ю-2.
Гель-диффузионная реакция преципитации.
д _ одномерная диффузия (метод Удена). Пробирку частично заполняют агаром, содержащим антисыворотку. После затвердевания агара его покрывают сверху слоем агара, содержащего антиген, который также затвердевает. Далее антиген диффундирует в антисыворотку. Б—Г— двойная диффузия в двух направлениях (метод Ухтерлони). Чашку Петри заполняют гелем агара, в котором делают три цилиндрические лунки. Одну из них заполняют антисывороткой (темный кружок), а две другие — антигеном. В части 5 обе верхние лунки заполнены одним и тем же антигеном. В части В верхние лунки заполнены разными антигенами, а нижняя содержит антитела к обоим антигенам. В части Г в нижней лунке находится антитело к одному из антигенов; слева в верхней лунке находится антиген, а справа — перекрестно-реагирующий антиген. Д — фотография пластинки, полученной по методу Ухтерлони. Рассмотрим только внешние зоны, так как внутренняя полоса соответствует примеси белкового происхождения. Лунки а, с и е содержат экзопуклеазу фага X Е. coll. Лунка b содержит иммунологически неотличимый белок, так как полосы здесь сплошные. Лунки d и f содержат отличающиеся экзонук-леазы, вступающие в перекрестные реакции (обратите внимание на шпоры) [Radding С. M.f Methods Enzymol., 21, 458—462 (1971)]. l — t = 0; 2 — через некоторое время; 3 — через большой промежуток времени.
точки эквивалентности между лунками антитела и антигена по* является преципитиновая линия. Если две лунки антигена содержат один и тот же антиген, получается кривая, показанная на рис. 10-2, Б. Если антигены различны, появляются две независимые линии, которые пересекаются, как показано на рис. 10-2,В. Если между двумя антигенами имеется перекрестная реакция, то наблюдается картина, изображенная на рис. 10-2, Г. Небольшая область сбоку от кривой на рис. 10-2, Г называется шпорой и почти всегда указывает на менее активный антиген. Два различных слабо реагирующих антигена, вступающих при этом в перекрестную реакцию, дают пересекающиеся полосы, как на рис. 10-2, В, поэтому их можно спутать с независимыми веществами. Однако перекрест представляет собой шпоры только в случае их меньшей плотности по сравнению с основной линией и когда они имеют ярко выраженную кривизну. Метод Ухтерлони можно использовать для идентификации неизвестного вещества путем сравнения с известным, так как в случае их идентичности наблюдается картина, показанная на рис. 10-2, 5.
Фиксация комплемента
Сыворотка крови содержит целый класс белков, не являющихся иммуноглобулинами и носящих название комплемента или К'. Комплемент не реагирует с антигеном или антителом по отдельности, однако взаимодействует с разнообразными комплексами антиген — антитело. По неясным пока причинам комплемент не реагирует с комплексами гаптен — антитело. Поэтому для определения гаптенов обычно используют метод торможения (см. следующий раздел).
