Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
целлюлоза
1 иодирование 1251
А * прибавление []:
Я * антигена ц-j* элюирование D:
а а: 0:
—* ’ отделение
5 ^ и измерение
радиоактивности
РИС. 10-9.
Схема иммунорадиометрического анализа. Детали описаны в тексте.
Иммунорадиометрический анализ
В некоторых случаях не удается найти подходящего способа для получения радиоактивного антигена, поэтому применить метод радиоиммунологического анализа не представляется возможным. Такие вещества определяют с помощью иммунорадиометрического анализа (ИРА). Принцип работы метода изображен на рис. 10-9. Очищенный антиген адсорбируется или связывается со стабильным носителем, таким, как целлюлоза (или сефароза, обработанная бромцианом, см. гл. 8). Очищенный иммуноглобулин (ИГ), полученный из сыворотки, содержащей антиген-специфи-ческое антитело, прибавляют к такому конъюгату. Неадсорбиро-ванные антитела удаляют промыванием, а адсорбированное ан-тиген-специфическое антитело иодируют радиоактивным иодом (обратите внимание, что здесь в отличие от РИА радиоактивным является антитело, а не антиген). Радиоактивное антитело затем удаляют с адсорбента и используют для анализа. Для этого Ат* смешивают с анализируемым антигеном, применяя избыток антитела (в РИА используется избыток антигена). Смесь прибавляют к целлюлозе, содержащей Аг, с которой может связываться только непрореагировавшее Ат *. Прореагировавшее Ат * отмывают и определяют его количество по радиоактивности, получен-
прибавление анализ
антигена,
связанного
с целлюлозой
ное значение дает возможность определить количество Аг. Имму-норадиометрический метод анализа пока не нашел широкого применения, однако этого следует ожидать в будущем.
Примеры использования иммунологических методов в биологическом анализе
Приведенные ниже примеры демонстрируют разнообразие систем, которые можно исследовать с помощью иммунологических методов. Заметим, что в некоторых случаях иммунологический анализ используется для качественных характеристик, что связано с его исключительной чувствительностью. В других случаях он служит точным количественным методом.
Пример 10-А. Идентификация и классификация различных бактерий с помощью агглютинации. Многие бактерии, выделенные из природных источников или полученные от больных, можно идентифицировать преципитацией или агглютинацией специфическими антителами, полученными против определенных штаммов (рис. 10-10). Реакцию можно наблюдать либо под оптическим микроскопом (при этом видно слипание), либо по изменению мутности суспензии, которая измеряется спектрофотометрически.
Пример 10-Б. Идентификация вирусов по ингибированию гем-агглютинации, вызываемой вирусом. В клиниках и лабораториях часто приходится сталкиваться с необходимостью идентификации вирусов. Эта задача легко решается при использовании простого анализа ингибирования. Некоторые типы вирусов обладают свойством вызывать слипание эритроцитов (гемагглютинация). Нели данный вирус вызывает агглютинацию, то прибавление антитела, полученного против этого вируса, будет его связывать, предотвращая тем самым гемагглютинацию, однако другие ан-
РИС. 10-10.
Агглютинация бактерии Е. coli при добавлении специфической антисыворотки.
А — в отсутствие антисыворотки; Б — при добавлении антисыворотки.
РИС. 10-11.
Слипание частиц полистирола, покрытых гонадотропином, при действии антигонадотропина.
А — в отсутствие аптисывортки; Б — в присутствии антисыворотки.
титела не будут давать такого эффекта. Таким образом, при наличии большого набора антител, полученных против разнообразных вирусов, можно определить и исследуемый вирус.
Пример 10-В. Обнаружение гонадотропинов в моче беременных женщин методом торможения и пассивной агглютинации. Небольшие частицы полистирола можно покрыть гонадотропином человека — гормоном, который найден в моче беременных женщин. Прибавление антигонадотропина приводит к слипанию таких покрытых частиц (рис. 10-11); это явление хорошо видно с помощью оптического микроскопа. Если к таким покрытым частицам добавить мочу беременной женщины перед прибавлением антитела, то гонадотропин мочи будет конкурировать с покрытыми частицами за место на антителе, поэтому агрегаты образовываться не будут. Это свойство обычно используется в качестве теста на наличие беременности.
Пример 10-Г. Изучение синтеза нити отростка фага в инфицированной бактерии Е. coli с помощью метода торможения. Антитела, полученные против бактериофага Т2 Е. coli, направлены в первую очередь против нити отростка фага Т2. Исходя из этого, прибавление анти-Т2 инактивирует фаг, предотвращая его адсорбцию хозяином. Внутриклеточный синтез нитей отростка можно проследить, получая экстракты клеток через различные промежутки времени после инфекции, смешивая аликвоты с анти-Т2 и прибавляя затем фаг. Если в аликвоте присутствуют нити отростка, они будут связываться с анти-Т2, анти-Т2 будет титроваться (иными словами, ингибироваться), а фаг будет продолжать свое существование. Эта процедура служит примером ин-
