Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 10-12.
Анализ блокирующей способности сыворотки.
К фагу Т2 добавляли анти-Т2 вместе с различными количествами экстракта бактерий, зараженных мутантным фагом, лишенным способности образовывать головку. Антисыворотка инактивирует фаг в отсутствие экстракта. Если в экстракте имеются отростки фага (против кото* рых направлена антисыворотка), то они будут конкурировать с фагом за связывание с антителом, при этом фаг будет жизнеспособным. Это можно использовать для определения числа фагов, эквивалентного числу отростков, имеющихся в экстракте.
РИС. 10-13.
Определение синтеза ДНК фага Т4 Е. coli с помощью фиксации комплемента.
coli В была инфицирована пятью фагами на бактерию. Через разные промежутки времени отбирались пробы, которые анализировались на присутствие глюкозили-рованной ДНК с использованием фиксации комплемента с антителом к глюкозилированной ДНК. Принцип этого метода заключается в том, что ДНК ?• coli не глюкози-лирована, поэтому она не реагирует с антителом, тогда как ДНК фага Т4 содержит глюкозилированный 5-оксиметилцитозин. Поэтому антитело обнаруживает ДНК фага Т4 и не «замечает» значительно большего количества бактериальной ДНК [Levine L., Murakami W. Т., Van Vurtakis ИGrossman L., Proc. Nat. Acad. Sci., 46, 1038-1043 (I960).]
гибирующей способности антител. Таким образом, число жизнеспособных фагов, остающихся после такой обработки, является мерой количества нитей отростка в экстракте (рис. 10-12). Этот метод известен среди исследователей фагов под названием метода блокирующей способности сыворотки.
Пример 10-Д. Измерение синтеза ДНК фага Т4 в инфицированной Е. coli с помощью фиксации комплемента. Можно получить антитела к денатурированной глюкозилированной ДНК-ДНК бактериофага Т4 Е. coli содержит глюкозилированный 5-оксиметилцигозин вместо цитозина, поэтому ее можно отличить от ДНК?. coli, так как последняя не будет реагировать с антителами. Ход синтеза ДНК фага Т4 в течение инфекции можно проследить с помощью фиксации комплемента, путем приготовления экстрактов клеток, денатурирования ДНК и определения количества глюкозилированной денатурированной ДНК (рис. 10-13).
Пример 10-Е. Влияние денатурирующих агентов на ДНК. Денатурация ДНК обычно изучается путем измерения увеличения оптической плотности при 260 нм (гл. 14). Однако такой метод нельзя использовать в тех случаях, когда потенциальный денатурирующий агент сам обладает поглощением при этой длине вол-
лизата
Время, мин
ны. Для обнаружения денатурации можно воспользоваться иммунологическим методом, поскольку некоторые антитела к ДНК реагируют только с денатурированной ДНК. Действительно, методом фиксации комплемента было проанализировано большое число дестабилизирующих веществ, причем степень денатурации определялась как функция концентрации денатурирующего агента. Некоторые данные, полученные таким методом, приведены в табл. 10-2.
ТАБЛИЦА 10-2
Концентрация реагентов, при которой при температуре 73°С и ионной силе 0,043 происходит 50%-ная денатурация ДНК из бактериофага Т4 Е. coli (определенная методом фиксации комплемента)а
Реагенты Кондентраци я мол ь/ л
Метанол.................... 3,50
Этиленгликоль................. 2,20
Глицерин .................... 1,80
1,4-Диоксан.................. 0,64
Фенол ..................... 0,08
Формамид ................... 1 *90
Мочевина ................... 1,00
Тномочевина.................. 0,41
а Данные взяты из работы: Levine L.t Gordon J. A., Jencks W. P., Bio hem., 2, 168—
175 (1963). ДНК помещали в растворы, содержащие различные концентрации реагентов, к инкубировали при 73 С. Затем растворы разбавляли и определяли методом фиксации комплемента, используя при этом антитела к ДНК» которые реагировали только с одноцепочечной ДНК. Было опробовано 54 различных реагента.
Пример 10-Ж. Идентификация р-белка фага X Е. coli. При инфицировании ?. coli фагом К синтезируется большое количество экзонуклеазы. Эту нуклеазу очищают, после чего получают ан-ти-А, экзонуклеазу. При проверке гомогенности методом иммунодиффузии Ухтерлони (рис. 10-14) обнаруживаются две зоны, показывающие, что в «чистом» образце содержится как минимум два белка. Одна полоса является продуктом рекомбинации гена, называемого экзо. Другая отвечает продукту другого гена, называемого бета. (3-Белок образует комплекс с экзонуклеазой, однако не проявляет ферментативной активности in vitro. Его синтез и генетический контроль изучают методом иммунодиффузии, так как для анализа (3-белка не существует другого метода.
Пример 10-3. Обнаружение полимеразы III ДНК Е. coli в присутствии полимеразы I методом нейтрализации. Если два фермента принимают участие в сходных реакциях, часто бывает затруднительно провести анализ одного из них в присутствии другого. При анализе ДНК-полимераз белок, несущий активность
РИС. 10-14.
