Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Анализ экзонуклеазы и р-белка фага % Е. coli методом Ухтерлони.
Центральная лунка содержит антитело, полученное против предположительно чистой экзонуклеазы. Лунка 1 содержит экзонуклеазу высокой чистоты, и здесь видна одна линия преципитации. В лунке 3 содержится та же экзонуклеаза, но менее чистая, чем в лунке 1. Лунка 2 содержит частично очищенный экстракт клеток, зараженных фагом X дикого типа. Здесь присутствуют зона экзонуклеазы и внутренняя зона р-белка. В лунке 4 тот же препарат, что и в лунке 2, но менее чистый. Лунка 5 была заполнена продуктом, полученным при заражении мутантным фагом А, известным под названием til. Этот мутант производит излишек экзонуклеазы и не дает всех репликативных и структурных белков фага. Видно, что здесь присутствует fJ-белок, т. е. он образуется в части генома, содержащей экзоген, а не в структурной или репликативной областях. В лунке 6 находился экстракт из .V-мутанта фага К. В этом случае отсутствуют обе зоны, что указывает на контроль геном N синтеза экзонуклеазы и р-белка [Radding С. М., Shreffler D. С., J. Mol. Biol., 18, 251—261 (1966)].
полимеразы I, можно удалить из экстракта клеток путем прибавления антиполимеразы I перед введением экстракта в реакционную смесь. Нейтрализующая способность антитела используется в биохимии для однозначного анализа полимеразы III.
Пример 10-И. Определение мутантных белков или белковых фрагментов при помощи перекрестных реакций. Белки из мутантных генов содержат либо новую аминокислоту вместо определенной аминокислоты, присутствующей в белке дикого типа, либо фрагменты нормального белка, если мутация вызывает терминирование цепи. В обоих случаях активность белка (например, ферментативная) теряется, в результате чего биохимический анализ оказывается несостоятельным. Если измененный белок или фрагмент продолжает содержать ту же антигенную детерминанту (например, аминокислотную последовательность), что и белок
дикого типа, то его можно обнаружить иммунологическим методом. Наилучшими методами для этого служат фиксация комплемента, иммунодиффузия или радиоиммунологический анализ. Пример такого подхода показан в табл. 10-3.
ТАБЛИЦА 10-3
Иммунологические перекрестные реакции между р-галактозидазами различных мутантов Е. сой а
Участок генетической карты, в котором Количэство белка, при котором фиксация
произошла мутация комплемента происходит на 50% мкг
Дикий тип 0,06
1 Офв
2 ОФ
3 ОФ
4 ОФ
5 4,0
6 1,0
7 2,0
8 ОФ
9 ОФ
10 1,4
11 0,5
12 1,4
13 0,6
14 1,3
15 0,5
15 0,5
Выводы; 1. Фермент З-галактозидаза может быть определен иммунологически, даже если не заметна активность.
2. Участки I—4 и 8—9 либо являются антигенными, либо более э]){>ек-тивно изменяют трехмерную конформацию антигенного участка, потому что мутации в этих участках уничтожают всю антигенную активность.
а Данные взяты из работы: Fowler А. V.. Zabin /¦* J. Mol. Biol., 33> 35—47 (1968).
6 Чем ближе величина к величине для белка дикого типа, равной 0,06, тем сильнее антигенная детерминанта мутантного белка похожа на антигенную детерминанту белка дикого типа.
в Отсутствие фиксации.
Пример 10-К. Обнаружение родства между белками при помощи перекрестной реакции. Некоторые белки, например находящиеся в глиальных клетках мозга, широко распространены в природе. Антитело к конкретному белку глиальных клеток кролика можно найти с помощью фиксации комплемента при реакции с белками из различных образцов нервных тканей, простирающихся в эволюционных пределах от лягушки до человека. Характерные данные, которые можно получить в качестве свидетельства родственности структур, приведены в табл. 10-4.
ТАБЛИЦА Ю-4
Перекрестные реакции между белками S-100 из мозга различных животных и антителами к белку S-100 крупного рогатого скотаа