Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
10-3. Можно ли ожидать, что реакция между специфическим антителом и белковым антигеном (анализ может проводиться любым способом) будет зависеть от того, является ли белок нативным или денатурированным? Объясните.
10-4. Почему замена одной аминокислоты в белке будет а) приводить к потере всей антигенности, б) не вызывать никакого изменения или в) давать материал, вступающий в перекрестную реакцию?
10-5. Предположим, что требуется определить содержание определенного препарата в крови животного. Обычный химический анализ применить не удается из-за наличия в крови белка. Как здесь можно использовать иммунологические методы? Опишите все необходимые для анализа стадии.
ЧАСТЬ
ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ГЛАВА
Седиментация
Одним из наиболее распространенных методов характеристики макромолекул в настоящее время служит седиментация *. С помощью соответствующих вариантов этого метода можно получить данные о молекулярной массе, плотности и форме макромолекулы, обнаружить изменения этих параметров, причем любой из них можно затем использовать в качестве основы разделения компонентов смеси как для аналитических, так и для препаративных целей. Особенно привлекательным сделался метод в последнее время в связи с появлением новейших автоматических приборов^ позволяющих легко и быстро проводить необходимые измерения.
В принципе при ультрацентрифугировании всегда происходит одно и то же: частицы движутся под действием центробежной силы, и их концентрационное распределение по длине центри-фужной пробирки определяют через какое-либо время или через промежутки времени. Измерение движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определены-ем скорости седиментации, в результате чего получается коэффициент седиментации, значение которого дает информацию о молекулярной массе и форме частицы. Когда распределения концентрации измеряются при таких условиях, при которых распределение не изменяется во времени, говорят, что частицы достигли седиментационного равновесия; эти данные дают сведения о молекулярной массе, плотности и составе.
* Седиментация — это общий термин для обозначения движения в поле центробежной силы. Если седиментационный анализ проводится с использованием высокоскоростной центрифуги, которая, называется ультрацентрифугой, обычно применяют название «ультрацентрифугирование».
Седиментация базируется на очень простых принципах. Однако на практике необходимо учитывать некоторые усложнения для того, чтобы получить значимую информацию.
В данной главе будут рассмотрены как принципы, так и сложности многих способов ультрацентрифугирования, а также примеры измерений, которые доступны с применением рассмотренных методик.
Основы теории скорости седиментации
Если частица находится в поле центробежной силы, образующейся при вращении ротора с угловой скоростью со, на нее будет действовать центробежная сила /гп = /па>2г, где т — масса частицы, а г — расстояние до центра вращения. Если частица находится не в вакууме, а в растворе *, молекулы растворителя, естественно, будут вытесняться при движении частицы. Их сопротивление вытеснению составляет выталкивающую силу, направленную против центробежной силы. Фактор плавучести понижает общую силу, действующую на макромолекулу, на величину массы вытесненного раствора, умноженной на а)2г; эта масса равна объему частицы, умноженному на плотность растворителя р. Объем частицы равен mv, где v — парциальный удельный объем частицы **, откуда выталкивающая сила равна a)2rmvр.
Ясно, что частицы и молекулы растворителя не могут двигаться относительно друг друга без заметного трения. Сила трения, направленная против движения частиц и молекул растворителя, пропорциональна разнице между скоростями частиц и молекул растворителя и выражается значением fv, где/—коэффициент трения, г v — скорость относительно ячейки центрифуги, содержащей раствор. Так как скорость постоянна при общей силе, равной нулю, скорость частицы
v= 0)2m ^ ~~ ^ . (1) /
Из уравнения (1) следует (при равенстве всех прочих факторов):
1. Более массивная частица (или молекула) будет стремиться двигаться быстрее, чем менее массивная.
* Под растворителем здесь понимается суспендирующая среда, т. е. если частица находится в воде, то растворителем является вода, если она находится в NaCl с определенной концентрацией, растворителем будет раствор NaCl.
** Подробное рассмотрение парциального удельного объема приведено в гл. 12.
2. Более плотная частица (т. е. обладающая малым парциальным удельным объемом) движется быстрее, чем менее плотная.
3. Чем больше плотность раствора, тем медленнее будут двигаться в нем частицы.
4. Чем больше коэффициент трения, тем медленнее движение частиц.
Эти четыре положения составляют основные правила седиментации и приложимы ко всем частицам независимо от того, являются ли они крупными структурами, макромолекулами или небольшими молекулами.
Поскольку скорость молекулы пропорциональна величине поля центробежной силы (т. е. со2г), обычно седиментационные свойства рассматриваются в зависимости от величины скорости, деленной на центробежное ускорение:
