Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 105

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 218 >> Следующая

Коэффициент седиментации макромолекул зависит от ряда факторов, что связано с 1) зависимостью формы молекул от состава растворителя, 2) наличием у многих молекул зарядов, 3) их большим размером в сравнении с размерами молекул растворителя и 4) деформациями макромолекул при движении. Результатом этих эффектов является зависимость s от концентрации, скорости центрифугирования и ионной силы растворителя.
Зависимость s от концентрации
Рассмотрим раствор макромолекул такого размера, что они часто сталкиваются друг с другом. Это характерно для очень больших или вытянутых молекул (таких, как белки и нуклеиновые кислоты), поскольку при их вращении в растворе они эффективно занимают относительно большой объем раствора. При приближении одной такой макромолекулы к другой молекулы растворителя движутся в противоположном направлении с большими трудностями, т. е. вязкость растворителя вблизи макромолекул заметно увеличивается. Результатом этого является уменьшение скорости движения частицы под действием центробежной силы и
РИС. 11-13.
Концентрационная зависимость s, выраженная функцией s/s° от концентрации, где s°— значение s, экстраполированное к нулевой концентрации. Обратите внимание, что концентрационная зависимость становится более сильной в случае увеличения молекулярной массы и более вытянутых молекул.
1 — небольшие глобулярные молекулы белка; 2 — фаг 0 XI74; 3 —ДНК фага Т7;
4 — ДНК фага Тб.
20 АО 60 80 100 120 140 Концентрация, мкг/мл
поэтому уменьшение $. Так как вероятность столкновения (или сближения) возрастает с увеличением как молекулярного объема, так и протяженности молекулы, степень зависимости от концентрации также возрастает с ростом этих параметров. Это показано на рис. 11-13, где изображены некоторые характерные кривые зависимости s от концентрации ДНК или белка. Как видно, наибольшая зависимость имеет место в случае больших вытянутых молекул (т. е. ДНК), тогда как для небольших сфер (фаг0 Х174) и глобулярных белков она невелика *.
До сих пор не существует детального теоретического описания концентрационной зависимости **. Однако эмпирическим путем найдено, что для большинства систем концентрационная зависимость лучше всего описывается уравнением
s(c) = s°/( 1 + kc)
* Невелика еще не означает, что несущественна. Например, белки обычно изучают при таких высоких концентрациях (порядка 0,5—5,0 мг/мл), что общее уменьшение S может быть значительным.
** Была сделана попытка улучшить уравнение (4). Например, было рассчитано, что s('cj) = s°(lH-^[r]]c), где [п] — характеристическая вязкость (гл. 13), a k — константа, имеющая значение 1,2 для стержнеообразных молекул и 1,6 для сферических. Однако и эта теория остается полуэмпирической, так как значение \г\] для большинства белков и полинуклеотидов не поддается простому расчету.
РИС. 11-14.
Количество ДНК фага Т2, получаемое по данным седиментадионного анализа смеси ДНК фагов Т2 и Т7 (1:1) при различных концентрациях ДНК (эффект Джонстона—Огстона).
10 20 30 и0 50 60 70 80
Концентрация, мкг/мл
ИЛИ
S (с) S° S0 ’
1 , kc
(4)
где 5° — 5 при концентрации, равной нулю, s(c) —5 при концентрации с, a k — константа для данной молекулы. Значение s° получают экспериментально путем измерения s при различных концентрациях, построения зависимости 1/s от с и установления значения 1 fs° экстраполяцией до с = 0. Очевидно, что 5° является наиболее полезным параметром, описывающим молекулу, поэтому его следует определять во всех случаях. В публикуемых работах это делается не всегда, поэтому важно иметь в виду, что между s° и 5, измеренным при стандартных концентрациях, могут быть существенные различия, что следует из рис. 11-13.
В случае смеси макромолекул с различными значениями 5 при относительно высокой концентрации возникает особая проблема. В этом случае молекулы мешают седиментации не только себе подобных, но и других типов молекул. К тому же молекула с большим s и большей концентрационной зависимостью, должна седиментировать через раствор более медленно движущихся молекул. При высокой концентрации более быстро осаждаемые молекулы будут так задерживаться, что они седиментируют почти с той же скоростью, что и более медленно осаждаемые молекулы; при этом может происходить «маскировка» того факта, что в действительности имеется смесь, и можно получить ошибочную информацию о гомогенности материала. Этот процесс носит название эффекта Джонстона — Огстона. На деле для разделения больших молекул нуклеиновых кислот часто приходится работать с очень низкими концентрациями, поскольку только в этих условиях происходит разделение двух компонентов. Однако даже при этих концентрациях полученные данные показывают меньшее содержание более быстро осаждаемого компонента, чем имеется в действительности. Пример этого дан на рис. 11-14. Как будет показано ниже (см. разд. «Зональное центрифугирование в предварительно подготовленном градиенте плотности»), эта трудность сводится к минимуму при использовании метода зонального центрифугирования.
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed