Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
где s — коэффициент седиментации. Определение s является непосредственной задачей в большинстве экспериментов по скоростной седиментации (см. «Приложение»).
В идеале при одной и той же температуре значение s будет постоянным для частицы в данном растворителе. Однако в случае макромолекул это не так, вследствие их больших размеров, поэтому здесь теория должна быть дополнена. Эти дополнения следовало бы привести здесь же, однако они будут более понятными при рассмотрении реальных седиментационных данных, поэтому сначала рассмотрим оборудование для ультрацентрифугирования и виды получаемой информации.
Оборудование для ультрацентрифугирования
Эксперимент с центрифугированием требует приборов, которые позволяют работать при точно известных скоростях с малыми отклонениями без температурных колебаний *. Современные ультрацентрифуги работают при больших ускорениях до 420 000± ±100 g с контролем температуры в пределах приблизительно 0,1°С. Существует два типа приборов — аналитические и препаративные. Аналитические центрифуги снабжены оптической си-
* Датой рождения метода ультрацентрифугирования считается 1923 г., когда Т. Сведберг разработал и построил первую ультрацентрифугу (см. список литературы в конце главы).
РИС. 11-1.
Аналитическая ультрадентрифуга фирмы Beckman.
Ротор находится в охлаждаемой камере в вакууме и подвешивается на струне, соединенной с ведущим валом мотора. В наконечнике ротора находится термисторный датчик температуры. Электрический контакт термистора с контрольным устройством осуществляется через сосуд с ртутью, с которой соприкасается наконечник ротора. Камера с ротором оборудована верхней и нижней линзами. Нижняя линза служит коллиматором, через нее в ячейку попадают параллельные лучи. Верхняя линза и камерная линза фокусируют проходящий свет на пленку, / — мотор; 2 — ротор; 3 — бронированная камера; 4 — зеркало; 5—камерная линза; 6 — путь света; 7 — держатель пленки; 8 — панель контроля скорости; 9 —* контроль температуры; 10 — источник света; 11 — вакуумный насос; 12 — охлаждение.
стемой, позволяющей определять распределение концентраций в любой момент времени в течение всего измерения, в то время как при использовании препаративных центрифуг требуется фракционирование содержимого центрифужной ячейки и измерение концентрации в каждой фракции для получения распределения концентраций. Название «препаративная центрифуга» употребляют не совсем правильно, так как, помимо использования для получения и очистки различных макромолекул и клеточных органелл, они почти столь же часто используются для количественного анализа смесей (т. е. как аналитический прибор).
На рис. 11-1 изображена схема аналитической ультрацентрифуги фирмы Beckman. Центрифуга имеет мотор, вращающий ротор. Ротор находится в защитной бронированной камере. Кроме того, имеется фотографическая система для регистрации распределения концентрации образца в ячейке центрифуги (подробное описание приведено в подписи к рисунку).
РИС. 11-2.
Аналитический ротор (с любезного разрешения Beckman Instruments).
/ — соединительная муфта; 2 — поддерживающее кольцо; 3 — отверстие для ячейки; 4 — термисторный датчик; 5 — подставка ротора; 6 — индексное отверстие.
Стандартный ротор для ультрацентрифуги фирмы Beckman показан на рис. 11-2. Ротор связан с электроприводом двигателя с помощью струны. В одном из отверстий ротора находится центрифужная ячейка, в другом — противовес. Кроме того, имеется индексное отверстие для определения расстояний от центра вращения. На рис. 11-3 показано устройство одного из простейших держателей образца — односекторной ячейки. Стенки ячейки сделаны таким образом, что при тщательной ориентации в роторе они параллельны силовым линиям центробежного поля. Это не дает материалу осаждаться на стенках. Ячейка состоит из сердечника, содержащего жидкий образец, двух окошек, корпуса, который держит сердечник и окошки, и отверстия для заполнения. Окошки обычно изготовлены из кварца, хотя в некоторых случаях для работы с очень большими скоростями их делают из сапфира, который меньше деформируется при больших нагрузках. Сердечник сделан из металла (обычно алюминия) или из пластика (Kel-F или эпоксидная смола). К достоинствам металлических сердечников следует отнести быстрое установление термического равновесия, что сводит к минимуму конвекцию, происходящую вследствие градиента температуры. С другой стороны, металл часто взаимодействует с растворителем или растворенным веществом; в таких случаях применяют сердечник из инертного пластика. Сердечник может быть выполнен и из титана, ко-
РИС. 11-3.
Ячейка центрифуги. Одно- и двухсекторный сердечник!* (с любезного разрешения Beckman Instruments).
/ — навинчивающееся кольцо; 2—прокладка кольца; 3 — держатель верхнего окна; 4 — уплотнительная прокладка; 5 —гильза окна; 5 — окно; 7 — прокладка сердечника; 8 — алюминиевый) сердечник; 9 — держатель нижнего окна; Ю — корпус ячейки; U — прокладка винта корпуса; 12 — винт корпуса; 13 — односекторный сердечник; Н — двухсекторный сердечник; /5 —верх: ячейки; 16 — воздух; 17 — мениск; 18 — растворитель; 19 — граница; 20—раствор; 21 — дно ячейки; 22 — ячейка центрифуги.
