Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Измерение распределения концентрации в аналитической ячейке
Во всех методах анализа распределения молекул при ультрацентрифугировании существует необходимость измерения концентраций компонентов. В существующих ультрацентрифугах для этого используются три различные оптические системы: шлиреновская, интерференционная и абсорбционная (обычно по ультрафиолетовому поглощению). Вряд ли здесь нужно детально рассматривать, каким образом эти оптические системы дают изображение, из которого получают концентрацию (это можно найти
м
м R м
R
Л
М
РИС. 11-10.
Шлирен-седиментограммы смеси двух белков.
Правая седиментограмма соответствует большему времени центрифугирования. Обратите внимание, что при большем времени отделяется небольшое количество более быстро движущегося вещества. Черные полосы соответствуют верху и дну ячейки. А — воздушное пространство над раствором в ячейке; R — индексные отверстия в контрбалансе, которые находятся на фиксированном расстоянии от оси вращения; М — мениск.
в описаниях к приборам), однако следует обсудить, каким образом изображение связано с распределением концентрации в ячейке центрифуги.
Шлиреновская система использует тот факт, что луч света не претерпевает отклонения при прохождении через область с однородной концентрацией, но отклоняется, проходя через участок с изменяющейся концентрацией, вследствие изменения показателя преломления, значение которого зависит от концентрации. Оптическая система в современных центрифугах преобразует это отклонение в кривую, показывающую градиент концентрации (рис. 11-10) *. Оптическую систему можно отъюстировать таким образом, что кривая будет более или менее четкой; однако в процессе юстировки площадь, ограниченная шлиреновской кривой и базальной линией, должна быть постоянной и пропорциональной концентрации. Концентрацию при этом можно определить путем измерения этой площади и использования определенных оптических констант данного прибора. При уменьшении концентрации вещества в ячейке площадь уменьшается также и может достичь такого предела, когда пик практически сольется с базальной линией; реальный нижний предел чувствительности шлиреновской оптики составляет концентрация порядка нескольких миллиграммов на 1 мл. Ценность шлиреновской системы заключается в возможности определения формы границы и установления присутст-
* Изобретение этой простой оптической системы, которая на самом деле дает график зависимости градиента концентрации от расстояния, было главным достижением в разработке метода ультрацентрифугирования, без которого эта техника, возможно, никогда не стала бы столь полезной. Систему разработал Дж. Ст. Л. Филпот и модифицировал X. Свенсон.
вия негомогенности в s. Эта система широко используется, особенно для определения коэффициентов седиментации белков *.
Для некоторых методик (особенно равновесия и приближения к равновесию) шлиреновская система недостаточно чувствительна для определения малых изменений концентрации. Для решения этих задач была разработана интерференционная система, в которой используется двухсекторная ячейка (рис. 11-3), один из секторов которой содержит только растворитель, а другой — раствор. При прохождении света через оба сектора получается оптическая интерференционная картина. (Механизм образования интерференционной картины описан в литературе, список которой приведен в конце главы. Здесь же достаточно будет сказать, что в основе оптической системы лежит интерферометр Рэлея, причем положение интерференционных полос является функцией показателя преломления в каждой точке ячейки. В то время как шлиреновская система дает зависимость градиента показателя преломления от расстояния вдоль ячейки, в случае интерференционной оптики каждая интерференционная полоса является кривой зависимости показателя преломления от расстояния.)
На рис. 11-11 изображены интерференционные картины, получаемые в различных ситуациях. В части А оба сектора заполнены только растворителем, поэтому полосы вдоль всей ячейки оказываются неотклоненными. В части Б один сектор содержит растворенное вещество, и полосы действительно отклоняются на расстояние, пропорциональное концентрации, хотя это и трудно обнаружить, поскольку все индивидуальные полосы выглядят одинаково. Если изучаемый материал гомогенен и имеет малый коэффициент диффузии, так что граница будет узкой (как ня рис. 11-7), получается картина, показанная в части В, где полосы сдвинуты вверх. В реальном случае граница имеет конечную ширину, в результате чего получается картина, изображенная в части Г. Часть Д показывает принцип определения концентрации по сдвигу полос; для этого продолжают линию от полосы около центра картины через картину вдоль ячейки и подсчитывают число пересеченных полос слева направо от точки отсчета А по направлению к дну ячейки. Как только продолжение линии не будет пересекаться с другими полосами, выбирают точку В, из которой проводят перпендикуляр, как показано на рисунке. Затем
* Как будет видно в дальнейшем, при использовании шлиреновской оптики требуемая концентрация бывает настолько высока, что имеет место сильная концентрационная зависимость. Это не мешает при работе с белками, однако дает сильный эффект в случае нуклеиновых кислот (см. рис, 11-13). О седиментационных свойствах ДНК не было почти ничего известно, пока не разработали более чувствительную УФ-абсорбционную оптическую систему.
