Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
1
Iр lq
РИС. 11-11.
Получение и анализ седиментограмм с помощью интерференционной оптики в двухсекторной ячейке.
Л — интерференционная картина, соответствующая одинаковым растворам в обеих секторах. Б — один сектор содержит раствор, а другой — растворитель (до начала центрифугирования). В — то же, что и в части Б, но через некоторое время после начала центрифугирования (образец гомогенен и имеет очень малый коэффициент диффузии). Г — то же, что и в части В, но раствор содержит вещество с очень высоким коэффициентом диффузии. Д — метод подсчета числа пересекающихся полос (см. текст). ? — седиментация бычьего сывороточного альбумина в Н20 при 60 000 об/мин в течение I ч; фотография получена при иомощи интерференционной оптики. Седиментация идет слева направо. Использована двухсекторная ячейка, один из секторов которой заполнен растворителем, а другой — раствором. Фотография получена для различных объемов жидкости в секторах, поэтому на ней можно видеть два мениска (М). Границе (В) соответствует искривление полос. Заметим, что полосы искривляются вверх по направлению к дну ячейки, так как вещество в процессе седиментации осаждается. Поскольку положение полос определяется концентрацией растворенного вещества, можно построить график зависимости концентрации вдоль ячейки.
РИС. 11-12.
А — седиментограмма ДНК фага Е. coli, полученная с применением системы регистрации по УФ-поглощению. Седиментация проходит слева направо. Обратите внимание, что на рисунке приведен позитивный отпечаток, тогда как в тексте говорится о негативном. Б — график, полученный при фото-метрировании степени почернения второго кадра в части А.
1 — верх ячейки; 2 — дно ячейки; 3 — внутренняя индексная грань; 4 — мениск; 5 —граница;
6 — наружная индексная грань.
1
2
3
Б
измеряют расстояния р и q. Отсюда относительная полоса равна plq. Изменение показателя преломления (Ап) при движении вдоль оси ячейки от левой стороны границы, где концентрация равна нулю, к точке В равно
Ап = A fl/d, (3)
где A<F— число пересеченных полос; % — длина волны света, использованного для получения полос; d — длина ячейки вдоль пути, проходимого светом (не путать с расстоянием в направлении
дентрифугирования). Поскольку отношение между п и концентрацией белка точно известно (его легко можно измерить для любого вещества с помощью рефрактометра), можно с большой точностью построить график зависимости концентрации от расстояния в ячейке (или изменения концентрации в области границы). (Отсюда можно получить форму границы, что дает возможность определить значение s.) Интерференционная система используется при концентрациях до нескольких сот микрограм-¦мов на 1 мл. примерно на один порядок меньших, чем в случае шлиреновской оптики.
Для нуклеиновых кислот зависимость s от концентрации настолько велика, что искали метод, позволяющий использовать концентрации менее 20 мкг/мл. Здесь на помощь приходит то обстоятельство, что молярный коэффициент поглощения (гл. 14) нуклеиновой кислоты при 253,7 нм (сильная линия в излучении ртутной лампы, применяемой в качестве источника света) очень велик. В связи с этим была разработана абсорбционная оптическая система. Вернемся к рис. 11-7, где изображено распределение концентрации вдоль ячейки. Если ячейку фотографировать в ультрафиолетовом свете, то степень почернения пленки будет уменьшаться с увеличением концентрации нуклеиновой кислоты. На рис. 11-12, А приведена типичная фотография седиментирую-щей ДНК. Если пленку после этого промерить с помощью фотометра, легко можно получить зависимость концентрации от расстояния (рис. 11-12, Б). В настоящее время пользуются разнообразными приборами, позволяющими обойтись без фотографирования, которые способны прямо измерять количество проходящего света и преобразовывать его с помощью фотоэлементов и соответствующих электронных устройств в зависимость концентрации от расстояния, изображаемую графически самописцем. Такие приборы называются сканирующими устройствами.
Некоторые аналитические ультрацентрифуги оборудованы теперь монохроматорами для выбора длины волны, что позволяет зарегистрировать молекулы с помощью абсорбционной оптики с использованием длины волны, соответствующей максимуму поглощения. Это дает возможность работать при значительно более низких концентрациях белка в тех случаях, когда белок обладает сильным поглощением (например, цитохром с или гемоглобин).
Факторы, влияющие на скорость седиментации
Прежде чем обсуждать сложные проблемы скорости седиментации, попробуем их представить себе на простых примерах. Предположим, что вы идете через комнату. Затем предположим, что вы пересекаете бассейн, причем вода доходит вам до шеи, а потом через такой же бассейн, но с патокой. Отсюда становится ясным, какое влияние на вашу скорость будет оказывать растворитель. Теперь представим, что вы пересекаете бассейн с раскинутыми в стороны руками. При этом ваш коэффициент трения возрастает, поэтому для перехода бассейна потребуется большее время, как следует из уравнения (1). Если в таком бассейне одновременно находится 100 человек, то вперед двигаться будет труднее, а с раскинутыми руками — еще труднее. Отсюда должно быть понятно, почему значение s становится меньше при высоких концентрациях, причем концентрационная зависимость больше для сильно асимметричных молекул. Предположим, что вы стараетесь бежать в воде с не полностью раскинутыми в стороны руками. Если вы при этом потратите в 2 раза больше энергии, то значит ли это, что для пересечения бассейна понадобится вдвое меньшее время? Теперь вы можете представить зависимость скорости. Позже вы увидите, что хотя интуиция подсказывает направление эффектов, на молекулярном уровне они могут отличаться от получающихся в бассейне.
