Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 10-0. Роль простагландинов в организме человека. Венозная кровь человека содержит в количествах от 10 до 100 пг/мл различные полииепредельные жирные кислоты, называемые простагландинами. Долгое время их значение оставалось невыясненным вследствие невозможности количественного анализа этих веществ с достаточно высокой чувствительностью. Применение радиоиммунологического анализа позволило обойти эти трудности и дало возможность проводить анализ большого количества образцов в короткие промежутки времени. Последнее особенно важно (т. е. постоянный контроль уровня в крови), поскольку недавно было установлено, что многие простагландины обладают фармакологической активностью, однако для них характерен узкий предел безопасных терапевтических доз.
Иммунологические методики для локализации веществ в клетках, тканях и молекулах; флуоресцентные антитела и антитела, связанные с ферритином
Флуоресцентный краситель флуоресцеин может связываться химической связью с большинством молекул антител, причем последние не теряют своей активности. Флуоресцеин можно использовать для локализации структур в клетках и тканях с помощью флуоресцентной микроскопии (гл. 2). Примером может служить идентификация клеток, с поверхностью которых связан определенный вирус, с применением антител против вируса, конъюгированных с флуоресцеином. Флуоресценция указывает на присутствие вируса несмотря на то, что размер вируса лежит за пределом разрешающей способности микроскопа (гл. 2).
С антителом может связываться также железосодержащий белок ферритин. Если специфическое ферритин-связанное антитело реагирует с клетками, после чего клетки исследуют методом электронной микроскопии, то молекулы антитела легко локализуют в тех же местах/ что и ферритин (темные пятна на рис. 10-16). Следует отметить, что при этом достигается высокое разрешение.
Список литературы
Berson 5. A., Yalow R. S., Radioimmunoassay: A Status Report, in “Immunology”, edited by R. A. Good and O. W. Fischer, Sinauer Associates, 1971, pp. 287— 293. Прекрасное руководство по методике радиоиммунологического анализа.
Bremer J. М., Pesce А. Achworth R. В., Experimental Techniques in Biochemistry, Ch. 4, Prentice-Hall, 1974.
Clausena L, Immunochemical Techniques for the Identification and Estimation of Macromolecules, in “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, vol. 1, edited by T. S. Work and E. Work, North-HoIIand, 1969, pp. 405—556.
Kabat E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, Holt, Rinehart and Winston, 1968.
Kwapinski J. ВMethodology of Immunochemistry and Immunological Research, Wiley-Interscience, 1972.
Wassermcin E., Levine L., Quantitative Micro-complement Fixation and Its Use in the Study of Antigenic Structure by Specific Antigen — Antibody Inhibition, J. Immunol., 87, 290—295 (1961). Изложение основных принципов микро-комплементарной фиксации.
Williams С. A., Methods in Immunology and Immunochemistry, Academic Press, 1967.
РИС. 10-16.
Пример использования ферритиновои метки.
Эритроцит человека разрушали и инкубировали с вирусом гриппа (указан стрелкой) и антителом, связанным с ферритином, которое было получено против белка спектрина. Вирус гриппа адсорбируется на внешней мембране эритроцита. Ферритин на фотографии выглядит как темные пятна и наблюдается только на противоположной стороне мембраны от вируса. Из этого следует, что спектрин главным образом, если не исключительно, находится на внутренней поверхности мембраны эритроцита. Полоска внизу равна 0,01 мкм [Nicolsoti G. L.f Marchesi V. Т., Singer S. J., J. Cell Biol., 51, 265—272 (1971)].
Задачи
10-1. Проведен анализ по фиксации комплемента с использованием антигена X и анти-Х. При добавлении различных количеств X была построена калибровочная кривая; при этом были получены следующие данные:
Количество D Количество D
прибавленного X, мкг прибавленного X, мкг
0,00 1,15 0,05 0,17
0,01 0,82 0,06 0,19
0,02 0,50 0,07 0,23
0,03 0,22 0,08 0,50
0,04 0,18 0,09 0,75
Вы хотите определить содержание X в экстранете клеток. Это делается путем прибавления 1 мкл экстракта с последующими его разбавлениями 1:1 и 1:2 смесью без добавления X; при этом были ^лучены значения оптической плотности 0,20, 0,66 и 0,85. Какова концентрация X в экстракте?
10-2. Предположим, что имеется ciiecb двух белков и антисыворотка, полученная против этой смеси. Если Два белка имеют одинаковую молекулярную массу и форму, то они будут обладать примерно одинаковыми коэффициентами диффузии (гл. 12). Если эту смесь подвергнуть диффузионному тесту Ухтерлони, с очень большой вероятностью при этом получится две зоны. Почему? При каких обстоятельствах может появиться только одна зона? Предположим, что два белка имеют различные коэффициенты диффузии; что может помешать разрешению зон?
