Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Рассмотрим зависимость концентрации от расстояния более подробно на примере серии Б. Кривая имеет два параметра, поддающихся измерению: расстояние седиментации (из которого
* Автор имеет в виду седиментацию нативной ДНК.— Прим. ред.
сШ
Л
м
РИС. 11-7.
Распределение концентрации в ячейках, заполненных тремя различными растворами, через одинаковый промежуток времени.
А — в растворе содержится только один тип молекул с одним коэффициентом седиментации; В — раствор содержит два компонента с различными коэффициентами седиментации; В — гетерогенная смесь с различными коэффициентами седиментации. Заметим* что вещество накапливается на дне ячейки. Нижний ряд показывает градиент концентрации; эти графики эквивалентны фотографиям, полученным с помощью шлиреновской оптики. Буквой М обозначен мениск.
определяется s) и относительную высоту двух границ. Поскольку концентрации аддитивны, высоты а и b соответствуют соотношению двух компонентов. Ясно, что если два компонента присутствуют в равных количествах, то а~Ь * в случае, когда эти вещества осаждаются независимо. В общем случае, если медленнее идущий материал а представляет собой часть (/) массы всего материала, то f — a/(a + b). Теперь вернемся к многокомпонентной системе. Если в ней присутствует три компонента, то получится граница, показанная на рис. 11-8, А. В общем случае, если смесь состоит из гетерогенной части с массовой долей f и быстроосаж-даемого компонента, количество которого определяется как -(I—/), будет получаться картина, изображенная на рис. 11-8,5,
* Все это справедливо, когда оба компонента имеют одинаковые коэффициенты экстинкции. — Прим. ред. л
А В В
РИС. 11-8.
Определение состава раствора методом скоростной седиментации.
А — раствор содержит три компонента в равных концентрациях; Б — раствор содержит главную фракцию, обладающую единственным значением s, остальное вещество движется медленнее и представляет собой гетерогенную смесь; аЦа+b) — доля гетерогенного вещества, а Ь/(а+Ь) — доля гомогенной фракции; В — раствор содержит несколько компонентов; ci и с2 —концентрации вещества со значениями s меньшими или равными и s2 соответственно, а (с2—с() — концентрация вещества с $i<s<s2.
для которой справедливо соотношение а/(а + 6)=/. Поскольку зависимость концентрации от расстояния легко преобразовать в зависимость концентрации от коэффициента седиментации, массовая доля материала с 5, лежащим между S\ и s2, составит (С2—Ci)/c, как показано на рис. 11-8, В.
Эти же рассуждения справедливы и для зависимостей градиентов концентраций, показанных на рис. 11-7, однако в этом случае следует измерять площади, а не расстояния.
Приведенный ниже пример показывает, как такие простые измерения могут дать значительную информацию о реальной молекуле.
Пример 11-А. Структура ДНК фага Т7 Е. coli. ДНК бактериофага Т7 Е. coli дает границу, изображенную на рис. 11-9, А. Эта ДНК дает одну четкую границу при всех исследованных концентрациях, так что ее можно считать гомогенной с точки зрения молекулярной массы. Если ДНК центрифугировать при pH 12,5, когда происходит разделение двух цепей, получается граница, показанная на рис. 11-9, Бу которая состоит из двух частей — четкой (гомогенной) и широкой (гетерогенной). Расстояние а/ (а + 6) равно 0,5; это означает, что 50% одиночных цепей ДНК осаждается медленнее, чем гомогенный компонент. Отсюда можно заключить (поскольку в этом случае известно, что меньший коэффициент седиментации соответствует меньшей молекулярной массе), что 50% одиночных цепей ДНК должно быть расщеплено. Так как более медленно движущийся материал осаждается достаточно гетерогенно, расщепленные цепи имеют различный размер, и поэтому разрывы могут происходить в разнообразных местах молекулы, скорее всего со случайным распределением.
В
пибо
1 .......I 50%
+
„1 ШГШ.ГШ 50%
ли?$о
I Ш. I 11 I 11 I «о*
лийо
11М1Ш1.ГТ 50 -ил 1 ишг х%
+
11ТТТТТТТТТ 50 ^
РИС. 11-9.
Седиментационный анализ ДНК фага 17 Е. coli.
Буквой М обозначен мениск, а стрелками — направление седиментации. Л — нативная ДНК дает одну резкую границу, показывающую, что молекулы не расщеплены. 5 — седиментация в щелочи, при которой происходит разделение цепей, показывающая, что некоторые единичные цепи являются интактными (а), а некоторые содержат разрывы (Ь). Поскольку а=Ь, концентрация интактных молекул равна концентрации молекул с разрывами. Число разорванных молекул, естественно, больше, чем интактных. В — три возможные интерпретации полученных результатов.
Поскольку расщеплена половина одиночных цепей, то либо все молекулы в популяции двухцепочечной ДНК содержат разрыв в одной из цепей, либо половина двухцепочечных молекул не содержит разрывов, тогда как другая половина имеет разрывы в обеих цепях, либо здесь присутствует смесь цепей без разрывов, с одним и с двумя разрывами (рис. 11-9, Б). Полученные данные одни не позволяют различить эти предположительные возможности.
