Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Стандартные коэффициенты седиментации
Если изучение скорости седиментации проводить в различных системах раствор — растворитель, измеренное значение s будет зависеть от плотности раствора (влияние величины 1 — ?Jp), вяз-
кости раствора (в вязкой среде молекула будет двигаться медленнее) и температуры (в первую очередь из-за влияния температуры на плотность и вязкость). Для получения возможности сравнивать экспериментальные значения, полученные в различных системах растворителей и при различных температурах, наблюдаемые значения приводят к стандартным растворителю и температуре. При этом принимается, что изменение системы не приводит к изменению парциального удельного объема и коэффициента трения. Это предположение, по-видимому, довольно справедливо (хотя и не всегда обосновано), пока концентрация противоионов не слишком велика, а в растворе отсутствуют молекулы, связывающиеся с макромолекулами *.
Условились приводить коэффициенты седиментации к стандартному растворителю, имеющему вязкость и плотность воды при 20°С, с помощью уравнения
с — о . 1 0 Р2о. ° . Jl_ . JL /5\
Ь20, в ьэксп _ >
JL
1 — V Т*20 Чо
где 52о, в — стандартное значение s, v — парциальный удельный объем, р2о, в и рт — плотности воды при 20°С и растворителя соответственно, т)/г|о — отношение вязкостей растворителя и воды, Л г/л 2о — отношение вязкости воды при температуре Г к ее вязкости при 20°С.
Соответствующие значения л Для многих систем растворитель — растворенное вещество можно найти в справочниках, отсутствующие в них величины могут быть определены с помощью вискозиметрии (гл. 13).
Для этой поправки, как и для расчета молекулярной массы, приведенного в конце данной главы, необходимо знать величину v. Методы определения значения v приведены в гл. 12.
* Проблема состоит в том, что почти все уравнения, используемые в центрифугировании, выводятся при допущении, что система состоит только из двух компонентов — молекул растворителя и молекул, седиментационные свойства которых требуется изучить. Однако на практике обычно этого не бывает вследствие добавления проотивоионов. Реальная концентрация противоионов составляет от 0,01 до 1,0 М, тогда как концентрация изучаемых молекул— от 1,0*10~5 до 1,0*10—3 М. Обычно это осложнение игнорируют, так как при концентрации соли менее 0,05 М не отмечается никаких аномалий. Однако для 1 М NaCl, служащего обычным растворителем для ДНК, должны быть введены некоторые поправки. Тем не менее, как правило, этого не делают, поскольку гидродинамическая теория седиментации ДНК еще до конца не разработана, так что эти поправки не вносят существенных различий. Однако проблема становится достаточно острой при седиментации белков в 5 М хлориде гуанидиния или 7 М мочевине.
Факторы, влияющие на значение стандартного коэффициента седиментации
Трение: влияние формы
Рассмотрим простой пример, показывающий, какие факторы влияют на коэффициент трения. Если шар и стержень с одинаковыми массами и плотностями центрифугировать в вязкой среде, можно интуитивно заключить, что шар будет двигаться быстрее, поскольку он более компактен. (Дело обстоит иначе, если ось стержня ориентирована вдоль направления движения. Однако броуновское движение заставляет стержень, как и любую другую частицу, вращаться, поэтому утверждение остается в силе.) Общее правило гласит, что, чем более вытянутую форму имеет объект, тем большим будет сопротивление его движению, т. е. возрастет коэффициент трения. Этот простой пример позволяет понять, почему коэффициент седиментации вытянутых полужест-ких молекул заметно увеличивается, если разрушить внутримолекулярную структуру, обеспечивающую повышенную жесткость. Наглядный пример этого можно полчить при изучении ДНК.
Пример 11-Б. Обнаружение денатурации ДНК с помощью ультрацентрифугирования. Жесткость молекулы ДНК обусловлена в первую очередь ее двухцепочечной спиральной структурой, в которой основания нуклеотидов расположены одно над другим (гл. 16), причем основания противоположных цепей связаны между собой водородными связями. При повышении температуры раствора ДНК водородные связи разрываются, в результате чего нарушается тенденция к регулярному расположению оснований. При потере жесткости из-за разрывов водородных связей между основаниями и нарушении их регулярной упаковки молекула ДНК приобретает способность изгибаться. В результате этого уменьшается «вытянутость» молекулы,, что приводит к увеличению s. Чем больше происходит внутримолекулярных разрывов, тем более гибкой становится молекула, менее жесткой и менее вытянутой, что приводит к увеличению s. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не разорвется последняя водородная связь. В этой точке происходит разделение двух цепей ДНК, что приводит к образованию двух единиц, каждая из которых имеет молекулярную массу, равную половине молекулярной массы исходной структуры. Иллюстрацией такого явления служит рис. 11-17, на котором приведена зависимость s для ДНК с молекулярной массой 25 000 000 от температуры раствора ДНК. За период разрывов значение 5 возрастает на 220%, после чего резко
