Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Зависимость седиментации от скорости
Зависимость седиментации от скорости включает два независимых явления — зависящую от скорости агрегацию молекул, которая проявляется при высоких концентрациях, и фактическое понижение s° при высокой скорости. Оба этих явления до конца еще не понятны, однако работы Бруно Зимма и его сотрудников позволяют высказать некоторые соображения по поводу каждого из них.
Зависящая от скорости агрегация выражается в кажущейся потере вещества из массы раствора, что приводит к понижению эффективной концентрации макромолекул (и поэтому к увеличению кажущегося значения s). Обычно это явление объясняют тем, что при большой скорости молекулы оставляют после себя след (подобный кильватерной струе, образующейся при движении корабля), который увеличивает скорость молекулы непосредственно позади нее. Это приводит к образованию агрегатов молекул, обладающих очень высоким значением s и быстро образующих осадок на дне центрифужной пробирки. Такой процесс продолжается до тех пор, пока концентрация не понизится на-
о?)/мин 9 945
М
РИС. 11-15.
Результаты фотометрирования седиментограмм ДНК фага Т4 Е. coli при регистрации по УФ-поглощению при трех скоростях.
В колонке А все стрелки, указывающие на основание границы, находятся приблизительно на равных расстояниях от мениска (М). Это справедливо и для колонки Б, однако расстояние в этом случае большее. Заметим, что при увеличении скорости ббльшая доля ДНК кажется седиментирующей быстрее, чем следует из значения s, рассчитанного для положния, указанного стрелками. Это значение s ожидается для данной молекулярной массы ДНК. Более быстрая седиментация происходит за счет агрегации, зависящей от скорости (см. текст). Седиментация происходит слева направо.
200
100
80
о* 60 е «
*° 40
20
od/мин хЮОО
______• 8 000
------. 10 ООО
------ 20000
------- 30000
Ю7 10s Ю9
Молекулярная масса
РИС. 11-16.
Два способа выражения скоростной зависимости s.
А — уменьшение 5 с увеличением скорости показывает, что этот эффект больше в случае большей молекулярной массы молекул. Приведены зависимости в случае ДНК интактных хромосом Е. coli и фагов Т2 и Т7. Молекулярные массы в том же порядке указаны на рисунке. Б — зависимость 5 от М как функция скорости (указаны об/мин).
столько, чтобы существование подобных агрегатов стало невозможным. На рис. 11-15 приведены данные, указывающие на существование такой агрегации, зависящей от скорости. Сравнивали концентрацию ДНК при трех различных скоростях через два промежутка времени. При самой высокой скорости концентрация ДНК во времени уменьшалась, что связано с образованием осадка. При самой низкой скорости она остается довольно постоянной. Отметим, что значения s, измеренные при самой высокой и самой низкой скоростях, составляют 50 и 37 соответственно. Такая кажущаяся потеря вещества служит веским доводом в пользу существования зависимости от скорости и указывает на необходимость проведения измерений при более низких скоростях.
Второй тип скоростной зависимости имеет место в случае очень больших молекул при низких концентрациях. Для ДНК Т4 (молекулярная масса 106 • 10е) при переходе от 65000 к 10 000 об/мин увеличение s составляет 9%. При еще больших молекулах ДНК!, молекулярная масса которых превышает 500-10®, скоростная зависимость становится значительной и может приводить к ошибке в 3 и даже в 8 раз при оценке молекулярной массы. Важность этого явления легко оценить, если принять во внимание то, что хромосомы бактерий и клеток эукариотов обладают ДНК с молекулярной массой в пределах от 2-109 до 10-109. В качестве иллюстрации на рис. 11-16 показано, что после достижения определенной скорости зависимость s от молекулярной массы исчезает. Зимм объяснил этот удивительный факт изменением формы (протяженности) молекулы ДНК при высокой скорости из-за увеличения торможения трением у концов молекулы. (Предполагают, что скоростная зависимость такого типа отсутствует для кольцевых молекул ДНК, однако пока это еще не проверено.) Отсюда ясно, что для проведения различий в молекулярной массе очень больших молекул ДНК необходимо использовать центрифугирование при весьма низких скоростях (или проводить измерения упруговязкостных свойств, см. гл. 13).
Влияние заряда
Если молекула заряжена (это обычное явление для биологических макромолекул) и седиментация проводится в растворе с низкой ионной силой (<0,01), наблюдаются сильные эффекты растворителя, которые не связаны с изменениями формы макромолекулы. Поскольку для макромолекул характерно большее значение s по сравнению с нейтрализующими ионами («противоионами», такими, как Na+ или Mg2+), ионизованная макромолекула седиментирует быстрее, чем противоионы. Распределение заряда приводит к возникновению градиента потенциала, противоположного направлению седиментации, который вызывает уменьшение s. Это осложнение легко устраняется при использовании избытка противоионов. В практике, например, используется избыток ионной силы 0,05.
