Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
стью на любом расстоянии от центра вращения. Эмпирическим путем было найдено, что таким свойством обладают растворы сахарозы с концентрацией от 5 до 20%. Важно помнить, что изо-кинетические свойства градиента концентрации зависят от изменения концентрации как функции расстояния вдоль пробирки; поэтому градиент от 5 до 20% сахарозы является изокинетиче-ским для определенной пробирки (например, пробирки для роторов фирмы Beckman SW39, SW50 и SW65), однако это не так в случае более длинных пробирок (например, SW25 и SW41). Таким образом, для пробирок различной длины изокинетические градиенты при необходимости должны подбираться каждый раз отдельно. Студенты должны это постоянно помнить при чтении литературы, так как это бывает одной из причин того, что разные лаборатории сообщают о различных значениях s.
Существование второй и третьей причин делает определение абсолютного значения s затруднительным, поэтому на практике обычно применяют совместную седиментацию с молекулами с известными s, для которых 5 определили в аналитической ультрацентрифуге, что позволяет установить относительное значение s. На самом деле такой прием является не совсем корректным по следующим соображениям: s20° в для двухцепочечиой
ДНК изменяется как М0-497 [уравнение (6)] при измерении в ячейке, имеющей форму сектора. Это уравнение будет справедливо в том случае, если ячейка содержит изокинетический градиент, в котором расстояние, проходимое в единицу времени (d), изменяется так же, как Af°>497. Однако при измерении соотношения между d и М в изокинетическом градиенте от 5 до 20% сахарозы в случае препаративной центрифуги получено соотношение
где индексы 1 и 2 соответствуют двум независимо седиментирую-щим компонентам. Поскольку s пропорционален расстоянию в изокинетическом градиенте, значение 5 ДНК в градиенте сахарозы от 5 до 20% в препаративной ячейке (с параллельными стенками) будет отличаться от найденного в ячейке, имеющей форму сектора, поскольку показатели степени у М различны. г(Скорее всего, это происходит вследствие конвекции, что обсуждалось во второй причине.) Из сказанного следует, что s нельзя определять из относительного расстояния. В случае белков дело обстоит не лучше. Однако проблема не так серьезна, как кажется, поскольку обычно значение s требуется только для оценки М. Так как соотношение s — М для большинства веществ является эмпирическим, таким же путем можно получить и соотношение d — М, используя относительные расстояния, проходимые за
определенные промежутки времени. Для ДНК такое соотношение описывается уравнением (7). Однако уравнение (7) имеет силу только для изокинетического градиента, и, по третьей причине, никогда не известно, является ли градиент изокинетиче-ским. Эта сложность может быть устранена с помощью редко применяемой методики совместной седиментации двух или трех веществ с известными молекулярными массами, берущими неизвестную М «в вилку», с последующим измерением относительного d для двух различных времен центрифугирования. Простой график зависимости относительных d от lg М позволяет получить точное значение М.
Примеры использования зонального центрифугирования в препаративной ультрацентрифуге
В приведенных здесь примерах зонального центрифугирования изучаются очень малые количества материала, которые не могут быть определены с помощью оптических методов. Отметьте разнообразие методов анализа и обоснованность выводов.
Пример 11-Ж. Обнаружение терминирования в синтезе РНК р-фактором Е. coli. При синтезе РНК РНК-полимеразой из матрицы ДНК синтез начинается с последовательностей оснований, носящих название промоторов, и оканчивается на терминирующей последовательности. Однако in vitro не получено данных о том, что терминирующая последовательность узнается. Джеффри Робертс выделил белок, который был назван р и понижал количество РНК, синтезируемой in vitro. Данные о том, что р дает информацию для узнавания терминирующих участков, были получены при анализе синтезируемой РНК методом зонального центрифугирования в градиенте сахарозы. Один из достаточно характерных экспериментов приведен на рис. 11-25. Если р понижает либо скорость инициации синтеза, либо скорость полимеризации после продолжительного периода синтеза (за который синтезируется большое число молекул), вид распределения молекул РНК должен быть одним и тем же как в присутствии р, так и без него. Если же он вызывает терминирование, молекулы РНК должны быть меньшими. Поскольку общая форма всех молекул РНК одна и та же, можно заключить, что в присутствии р синтезируемая РНК будет седиментировать более медленно, как показано на рис. 11-25.
Номер срракции
РИС. 11-25.
Зональная седиментация РНК, синтезируемой из матричной ДНК фага X Е. coli (градиент сахарозы 5— 20%).
Использованы две реакционные смеси, содержащие ДНК фага К РНК-полимеразу
Е. coli и соответствующий буфер.---------
РНК, синтезированная с включением 14С-
уридинтрифосфата (УТФ);------------РНК,
полученная с включением 3Н-УТФ в присутствии rho-фактора. Rho-фактор уменьшает молекулярную массу РНК. Седиментация справа налево [Roberts J. W., Nature, 224, 1168-1174 (1969)].
