Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
А — 3Н-ДНК фага Т7 и 3Н-ДНК фага Я; Б — ЯН-ДНК фага Т7 и 14С-ДНК фага Я; В-смесь двух ферментов; Г — включение 8Н-урацила в РНК №» указывает общее количество РНК). / — алкогольдегидрогеназа; 2 — каталаза.
(рис. 11-6). Если скорость протекания через отверстие достаточно мала, чтобы не вызывать турбулентности, каждая капля будет соответствовать единичному слою в пробирке. Каждая из фракций содержит одну или более капель. Для анализа веществ можно использовать разнообразные методы и в результате получать распределение концентраций. В аналитических центрифугах для определения молекул используют оптические системы (по УФ-поглощению, шлиреновскую или интерферометр Рэлея). Однако фракции, полученные при фракционировании содержимого пробирки по каплям, можно анализировать по радиоактивности, ферментативной активности, абсорбции, флуоресценции, с помощью химических тестов и т. д. Некоторые примеры использования этих методов показаны на рис. 11-24.
Для чего же в зональном центрифугировании нужен градиент концентрации? Посмотрим, что происходит при нанесении слоя раствора с низкой плотностью на раствор с высокой плотностью, в котором нет градиента концентрации. Вначале система будет стабильной за счет различий в плотности на границе раздела,
т. е. верхний раствор будет просто плавать на поверхности нижнего. Предположим теперь, что появляются небольшие изменения температуры в растворе (а они бывают всегда). Поскольку с повышением температуры плотность большинства растворов уменьшается, эти колебания температуры будут приводить к локальным инверсиям плотности (т. е. области с большей плотностью будут располагаться над областями с меньшей плотностью), что будет в свою очередь вызывать локальные перемещения жидкости, называемые конвекцией. Этот эффект обычно невелик и не оказывает существенного влияния на положение начальной границы, поскольку разность плотностей на границе обычно достаточно велика для того, чтобы перемешивания через границу не происходило (до тех пор, пока разность температур не становится больше 10—20°). Однако при седиментации изучаемые молекулы будут двигаться через более плотный нижний слой, где такая конвекция способна разрушить любую существующую зону. Введение крутого градиента плотности дает гарантию, что различия в плотности, способные вызвать потоки внутри градиента, могут быть результатом только очень больших изменений температуры. Второй важной функцией градиента плотности является предотвращение перемешивания в результате механических воздействий; любое возмущение будет нейтрализоваться стремлением системы вернуться к положению, при котором область с низкой плотностью расположена над областью с высокой плотностью. Кроме того, градиент позволяет решить еще одну проблему. Рассмотрим систему без градиента и без возможных температурных колебаний и механических воздействий, в которой седиментирующие молекулы уже проникли в нижний слой и образовали зону. В этой зоне наличие молекул увеличивает плотность раствора благодаря их собственному вкладу в плотность (обычно этот эффект очень мал, однако при использовании высоких концентраций он может быть значительным). Таким образом, плотность зоны больше плотности раствора сразу под ней, что приводит к появлению конвективных токов в зоне по направлению к дну ячейки. Если вместо этого седиментацию проводить в предварительно полученном градиенте концентрации, то седиментирующие молекулы будут постоянно проходить через область с большей плотностью. При этом плотность каждой области будет продолжать увеличиваться, однако при достаточно крутом градиенте вклад молекул в плотность будет недостаточным, чтобы привести к инверсии плотности, и система поэтому остается стабильной. Чаще всего для получения градиента используется сахароза, что связано с доступностью ее в чистом состоянии, низкой стоимостью и отсутствием взаимодействий с большинством химических реагентов, ферментов, а также возможностью применения оптических методов анализа. Если изучаемая макромо-
лекула представляет собой фермент или нестабильный белок, для создания градиента часто используют глицерин, в котором стабильно большинство белков, причем денатурирование в присутствии глицерина идет с большим трудом. С успехом применяют и градиенты Н2О — D2O; этот метод является наилучшим, когда лри изучении частицы требуется постоянное осмотическое давление. Примеры использования этих систем будут приведены ниже.
Определение коэффициента седиментации с помощью зонального центрифугирования в предварительно приготовленном градиенте плотности
При определении s с помощью зонального центрифугирования часто используют стандартные образцы (маркеры), значения s которых предварительно были определены методом аналитического ультрацентрифугирования. Однако даже в том случае, когда концентрация достаточно низка, чтобы можно было не принимать во внимание концентрационную зависимость седиментации (которая может достигать большой степени, если материал недостаточно чист), определение 5 с помощью зонального центрифугирования имеет подводные камни, которые не встречаются в аналитическом ультрацентрифугировании. Это можно объяснить тремя основными причинами. Во-первых, плотность и вязкость раствора увеличивается вдоль пробирки, поэтому суммарная сила, действующая на молекулу, здесь уже не является простой функцией расстояния. Во-вторых, стенки препаративных пробирок параллельны, поэтому они не совпадают с направлением седиментации, в результате чего происходит седиментация по стенкам с накоплением вещества. Это накопление приводит к локальным инверсиям плотности, вызывая некоторую конвекцию. В-третьих, значение s рассчитывается только по двум точкам, положению при времени, равном нулю, и после остановки центрифуги, так что истинная скорость движения остается неизвестной. Первая причина может быть рассмотрена очень сложным теоретическим путем, вторая теоретически описана, однако влияние ее на s до конца не установлено. Для избежания трудностей, связанных с первой причиной, обычно применяют изокинетические градиенты, т. е. концентрацию и плотность градиента подбирают таким образом, чтобы молекулы двигались с постоянной скоро-
