Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
интактная ДНК
интактные единичные цепи
I FT "Г Т I Т I И I 'I I | | 17 I1
+
J li I I I 1 I j j 1
рршмп
расщепленная ДНК
I 1 IT
ттт
Т-ГТ
ттттт
фрагменты
РИС. 11-30.
Результаты денатурирования интактной и расщепленной двухцепочечной ДНК.
две цепи имеют одинаковый размер и поэтому одинаковые значения 5 (рис. 11-30). Однако при наличии разрыва (предположим, что имеется только один разрыв в одной из цепей) получается одна интактная цепь и два фрагмента различного размера, т. е. три значения s. Если разрывы происходят случайно, образуется набор фрагментов всевозможных размеров. Это рассуждение, несомненно, можно распространить на случай одного или более разрывов в одной или обеих цепях. Главным здесь является возможность идентифицировать одноцёпочечный разрыв, поскольку при наличии его фрагменты будут осаждаться в щелочи медленнее, чем интактная цепь.
Выбор между различными конформациями ДНК можно сде,-лать на основании следующих соображений. Как говорилось в гл. 1, молекулы ДНК могут быть линейными, в виде незамкнуто^ го кольца (как минимум, один одноцепочечный разрыв) и в виде ковалентного кольца (не содержит разрывов). Возможны и комбинации этих типов. Так, например, две кольцевые молекулы могут быть связаны подобно звеньям цепи; такие структуры называются катенанами. Каждая из таких структур обладает характерным значением 5 (рис. 11-31), хотя различия и не слишком велики. Рассмотрим, что произойдет с каждой из возможных структур в щелочи (рис. 11-32). Линейная молекула будет диссоциировать на две отдельные цепи; кольцо с одноцепочечным разрывом разделится на две части — одну линейную и одну одноцепочечную кольцевую молекулы. Однако два одноцепочечных кольца, входящие в кольцевую ковалентную молекулу, не смогут разделиться, так как они переплетены друг с другом. Это приводит к тому, что в щелочи денатурированные ковалентные кольцевые молекулы сжимаются (коллапсируют) с образованием пере-
о
о
00
26 Коэффициенты седиментации различных кольцевых структур ДНК, выделенной из митохондрий лейкоцитов человека [Hudson ВClayton D. A., Vinograd I. ICold Spring Harbor Synip. Quant. Biol., 33, 435—442 (1968)].
34 A — мономерное незамкнутое кольцо; Б — димерное незамкнутое кольцо; В — катенановый димер; Г — мономерная суперспираль; Д — димерная суперспираль; Е — катенановая димерная суперспираль.
23
37
Д
Е
5!
51
нашивная денатурированная
О - о
щ
GO
РИС. 11-32.
Продукты денатурирования различных форм ДНК.
РИС. 11-33.
Разделение ковалентных колец (/), незамкнутых колец (2) и линейных молекул (5) путем седиментации в нейтральной среде (нативная ДНК) (Л) или в щелочи (денатурированная ДНК) (Б).
Время центрифугирования в части Б в два раза меньше, чем в части А. Обратите внимание на лучшее разделение ковалентных колец в щелочной среде.
путанной компактной структуры. Поскольку молекулярная масса при этом не изменяется и молекула становится более компактной, значение s сильно возрастает. На рис. 11-33 изображены два гипотетических результата седиментации смеси трех форм при центрифугировании в нейтральной и щелочной сахарозе. Полезным свойством ковалентных колец служит их необычная разде-ляемость, что использовано в приведенных ниже примерах.
Пример 11-Л. Идентификация небольших фрагментов вновь синтезируемой ДНК* фрагменты Оказаки. При выращивании бактерии Е. coli в среде, содержащей 3Н-тимидин, в течение многих поколений синтезируемая ДНК будет включать 3Н. При выделении этой ДНК и седиментации при нейтральном pH установлено, что значение s указывает на ее высокую молекулярную массу. Однако при седиментации этой же ДНК в щелочном градиенте сахарозы оказалось, что небольшая часть ДНК седимен-тирует очень медленно (рис. 11-34, А). Из этого было сделано предположение, что часть двухцепочечных молекул ДНК содержит близко расположенные одноцепочечные разрывы. Если нерадиоактивные клетки выращивать в течение всего лишь 5 с (0,2% поколения) в радиоактивной среде, затем отделять и анализировать в щелочном градиенте сахарозы, оказывается, что большая часть радиоактивности (т. е. вся ДНК, синтезированная за период 5 с) содержится во фракции с очень малым 5 (рис. 11-34, Б). Синтезированная за это время ДНК должна иметь множество близко расположенных одноцепочечных разрывов. Если клетки после выращивания в течение 5 с в радиоактивной среде перенести вновь в нерадиоактивную и выращивать в ней в течение 10 мин (74 поколения), седиментационный анализ в щелочном градиенте сахарозы показывает, что вся радиоактивность находится во фракции с высоким s (рис. 11-34, 5), т. е. «старая» ДНК не содержит одноцепочечных разрывов. Эти
