Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электро-форез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. coli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5'—З'-экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5'—З'-экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности.
Пример 11-И. Определение молекулярной массы ДНК фага Т7 с применением меченых концевых групп. Фермент полинуклео-тидкиназа Т4 может использоваться для введения радиоактивной метки по 5'-концу двухцепочечной ДНК (с помощью переноса 32Р из 7~32Р-АТФ на 5'-ОН-группу). Такая метка может применяться для определения молекулярной массы в том случае, когда известны количество ДНК и число связанных с ней атомов 32Р. Однако, если образец ДНК содержит расщепленные молекулы ДНК, значение М может оказаться заниженным, поскольку связано будет большое количество 32Р; например, если расщеплен 1% молекул на 100 фрагментов, наблюдаемое значение М будет
Номер фракции
Б
Ан° Номер фракции
пробирки
РИС. 11-26.
Зональная седиментация ДНК-полимеразы I Е. coli, выделенной из дикого штамма (Л) и из штамма, синтезирующего только фрагмент фермента (?}„ в градиенте сахарозы 5—20%.
Фермент дикого штамма обладает двумя активностями: полимеразная активность измеряется по включению 32Р-нуклеотида в нерастворимое в кислоте вещество (левая ось), а 5'—З'-экзонуклеазная— по удалению 32Р из полинуклеотида, меченного по концевой фосфатной группе 32Р (правая ось). В части Л обе активности седиментируют совместно, так как они соответствуют одному белку. В части Б мутантный фермент обладает только 0,4% полимеразной активности, однако более медленно движущийся фрагмент сохраняет 5'—З'-экзонуклеазную активность. [Lehman I. R., Chien J., J. Biol. Chem., 248, 7717— 7723 (1973)].
в 2 раза меньше истинного. Для определения количества атомов 32Р на интактную молекулу ДНК реакционную смесь можно проанализировать путем седиментации через градиент сахарозы (рис. 11-27). Рисунок показывает (причем такая ситуация часто встречается на практике), что значительная часть радиоактивности практически не седиментирует, оставаясь в верхнем слое гра-
РИС. 11-27.
Седиментограмма ДНК фага Т7, меченной по концевой группе 32Р с использованием полинуклеотид-киназы Т4.
?>2бо соответствует общей концентрации ДНК, активность 32Р позволяет определить число концевых групп. Заметьте, что зона у верха градиента не поглощает при 260 нм. Следовательно, в этом участке концентрация ДНК очень низка, а активность соответствует включению метки в мелкие фрагменты.
Номер фракции
диента. Однако главный пик отвечает интактным молекулам, поэтому из соотношения количества 32Р и концентрации ДНК в этом пике можно рассчитать значение М.
Пример 11-К- Частичная очистка осмотически нестабильной структуры, содерокащей гормон. Из гипоталамуса крысы можно выделить гормон, носящий название вещества Р. Дороти Фрай-фелдер и Сьюзен Лимен обнаружили, что гормон может выпадать в осадок из мацерированной ткани при очень малой центробежной силе, если ткань перед разрушением клеток суспендировать в 20%-ной сахарозе; в отсутствие сахарозы он не седиментирует даже при очень большой центробежной силе. Отсюда было сделано предположение, что гормон содержится в осмотически нестабильных частицах. Седиментация этих частиц через градиент сахарозы (от 5 до 20%) оказалась невозможной, так как слой образца немедленно опускался на дно. Применить градиент от 25 до 70% было нельзя, так как частицы, по-видимому, разрушались при высокой осмотической силе. Для решения этой проблемы был получен градиент из 20%-ной сахарозы в НгО и 20%-ной сахарозы в D2O. Полученный таким образом градиент достаточно стабилен за счет того, что D20 на 11% плотнее Н20, а постоянная концентрация сахарозы поддерживает необходимую силу осмоса. Седиментация через такой градиент дала возможность получить частично очищенные частицы.
Зональная седиментация в самогенерирующемся градиенте плотности
Часто бывает желательно проводить зональную седиментацию на аналитической ультрацентрифуге с использованием ультрафиолетовой абсорбционной оптики. Этот метод предпочтителен в случае, когда имеется очень маленький образец, который нельзя метить радиоактивными изотопами и анализировать химическими или ферментативными методами. Чтобы избежать затруднений, связанных с получением градиента плотности в ячейках аналитической ультрацентрифуги, Джером Виноград разработал методику зонального центрифугирования без предварительной подготовки градиента.
