Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Определение молекулярной массы методом седиментации — диффузии
В начале этой главы было показано, что
s = т (1 — v р)//\ (8)
где / — коэффициент трения. Значение коэффициента трения
предсказать трудно, однако можно воспользоваться тем, что он связан с коэффициентом диффузии D соотношением
D = RT/f, (9)
где R — газовая постоянная, а Т — абсолютная температура.
После преобразования этих уравнений приходим к следующему:
m = sRT/D( 1—up). (10)
Отсюда можно рассчитать значение m после измерения значений s и D и экстраполяции обоих до нулевой концентрации. Коэффициенты s и D либо измеряют в одном растворителе и при равной температуре (наилучший метод), либо полученные значения приводят к воде при 20°С. Последний метод более надежен.
Измерение коэффициента диффузии не представляет труда при использовании современных приборов; это будет обсуждаться в гл. 12. Следует, однако, заметить, что для очень больших вытянутых молекул, таких, как ДНК, значение D настолько мало, что точное его измерение невозможно.
Измерение молекулярной массы методом седиментационного равновесия
Метод седиментационного равновесия дает возможность прямого определения т, поскольку здесь нет необходимости определять
D. Метод заключается в том, что центрифугирование проводится при относительно низкой скорости, при которой седиментация молекулы настолько медленна, что уравновешивается диффузией; т. е. тенденции центробежной силы к понижению концентрации у мениска и увеличению ее у дна ячейки противопоставлена диффузия, стремящаяся к поддержанию одинаковой концентрации во всем объеме ячейки. При равновесии, конечно, концентрация у мениска меньше, чем у дна, однако эти значения остаются посто-
янными. Состояние равновесия описывается хорошо известным распределением Больцмана, которое в данном случае выглядит следующим образом:
^ = Г(г-щяг, (11)
С2
где Ci и с2 — концентрации молекул растворенного вещества на расстояниях г{ и г2 оси вращения, где молекулы обладают потенциальными энергиями Е\ и Е2, f — константа Больцмана. Разность потенциальных энергий Е\—Е2 представляет собой работу, необходимую для перемещения молекулы с массой т от г2 до ru т. е. против силового поля, или
п — 1 —
Et — Ег = — | m (1 — vp )a>2rdr = — m (l — vp )co2( r\ — r?). (12)
Гг
Объединяя уравнения (11) и (12) и заменяя k на газовую постоянную R таким образом, что единицы m (которые теперь становятся М) приобретают размерность единиц молекулярной массы (дальтоны) вместо граммов, получают следующее уравнение, которое можно использовать для расчета М непосредственно из данных центрифугирования:
м=——\пс-^ —!—, (13)
(1 — ур)о>з с (а) г2 — а2
где с(г) — концентрация растворенного вещества на расстоянии г от оси вращения, а а — расстояние от мениска до оси вращения. График зависимости Inс(г) от г2 представляет собой прямую линию, которая и используется для определения М (рис. 11-38).
Приведенный вывод основан на допущении, что система содержит только два компонента и что изменения плотности за счет изменений с и давления* пренебрежимо малы. При малых скоростях влиянием давления действительно можно пренебречь. Также невелики будут и изменения р в случае низких концентраций. При этом следует иметь в виду, что концентрация противоиона должка поддерживаться достаточно низкой, чтобы можно было говорить о двухкомпонентной системе. Может возникнуть вопрос, почему вообще речь заходит о противоионе? Это следует обязательно учитывать, поскольку обычно растворенные молекулы обладают зарядом, что приводит к образованию градиента электрического потенциала при распределении таких заряженных молекул. Противоион эффективно нейтрализует этот
* Давление возникает за счет действия поля центробежной силы.
РИС 11-38.
Данные седиментационного равновесия для альбумина бычьей сыворотки в 6 М хлориде гуанидиния при 27 690 об/мин и 20°С. Начальная концентрация белка равна 650 м к г/мл.
градиент, позволяя тем самым избежать серьезных затруднений, возникающих при отсутствии возможности такой нейтрализации.
К преимуществам метода равновесия следует отнести: 1) наличие прочной теоретической основы, 2) возможность работы с небольшими количествами вещества и 3) очень высокую точность измерений (ошибка не превышает 1%). Незначительным неудобством является большое время достижения равновесия (16—24 ч).
Определение молекулярной массы методом приближения к равновесию (метод Арчибальда)
В методе приближения к равновесию (часто называют методом Арчибальда по имени его изобретателя), как и в методе равновесной седиментации, молекулярная масса получается прямо из распределения концентрации, однако для этого требуется значительно меньшее время. Это бывает очень важно при исследовании нестабильных молекул.
