Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Температура, “С
РИС. 11-17.
Коэффициент седиментации четкой границы ДНК фага Т7, полностью или частично денатурированной нагреванием при указанной температуре в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,8) в присутствии формальдегида.
Формальдегид предотвращает повторное образование водородных связей при охлаждении раствора до 20°С для центрифугирования. Штриховая линия соответствует разделению цепей [Freif elder ?>., Davison P. Ft, Biophys. J., 3, 49—63 (1963)].
падает в точке разделения цепей (так как молекулярная масса уменьшается вдвое). Интересно, что это простое измерение было одним из первых указаний на то, что цепи ДНК способны разделяться.
Молекулярная масса
Из уравнения (2) следует, что s возрастает с увеличением М в том случае, когда парциальный удельный объем (iJ) и коэффициент трения (f) постоянны. Значения v обычно не претерпевают больших изменений при изменениях М, хотя они меняются в зависимости от аминокислотного состава белков. С другой стороны, коэффициент трения сильно зависит от М. За последние 20 лет было сделано немало попыток рассчитать зависимость между s и М (фактически соотношения f — М). Эта задача относительно проста для жестких стержней и твердых сфер, поэтому для глобулярных белков эта теория дает удовлетворительные результаты. Для гибких стержней, таких, как ДНК, этот подход не принес успеха, хотя недавно и был достигнут некоторый прогресс.
Для более обычных задач, связанных с использованием s для определения М или изменений М, проблема решается с применением эмпирических соотношений между s и М. Этот подход оказался успешным в случае ДНК, хотя применяемые уравнения постоянно модифицируются с целью более точных измерений М для
различных ДНК*. Для двухцепочечных Na-ДНК при нейтральном pH в 1 М NaCl в случае седиментации в ячейке секториаль-ной формы лучшим уравнением в настоящее время является следующее:
s%, в = 2,8 + 0.00834М0,497. (6)
К сожалению, это уравнение выведено на основании данных по сравнительно небольшому количеству молекулярных масс, поэтому со временем оно может несколько видоизмениться. Следует подчеркнуть, что значение s изменяется медленнее, чем М, поэтому только значение s нельзя использовать для определения М из-за возможности получения значительной ошибки. Например, ошибка в значении s в 5% приводит к получению для значениям ошибки, равной 10%. Значение s для ДНК можно измерить с точностью до 2%. однако это делается редко. Так как соотношение s — М получено эмпирическим путем, важно, чтобы это уравнение использовалось для определения М только в тех случаях, когда значение s не выходит за пределы (10—60), для которых это уравнение было получено.
Для глобулярных белков s изменяется приблизительно как М2/3, поэтому ошибка в 5% при измерении s дает ошибку около 7% при определении М. Так как s для белков может быть измерен с точностью до 1%, это позволяет получить достаточно достоверные результаты. Однако эмпирическое уравнение белков обладает тем недостатком, что s варьирует в зависимости от аминокислотного состава.
Как будет видно из следующего раздела, есть лучшие способы точного определения М, a s обычно измеряется для анализа изменений М или формы.
Метод точного измерения коэффициента седиментации
Поскольку измерение s связано с некоторыми ограничениями, крайне необходимо иметь метод, позволяющий получать достоверные значения s. Прежде всего, для устранения эффектов заряда ионную силу необходимо поддерживать в пределах от 0,05 до 1,0, а pH требуется регулировать подходящим буфером. Измерения нужно проводить при нескольких скоростях, отличающихся друг от друга приблизительно на 50%, чтобы удостовериться в отсутствии скоростной зависимости. При данной скорости сле-
* В литературе имеется и ряд других уравнений. Их недостатком является то, что они получены на основе М, значения которых определены с серьезными ошибками. Источники этих ошибок обсуждаются в некоторых ссылках, приведенных в конце главы.
дует использовать по меньшей мере четыре концентрации (включая наименьшую доступную концентрацию), чтобы убедиться в однородности вещества или установить точное соотношение компонентов, а уже потом определять s°. После этого рассчитывают s°2o, в. Простой метод расчета s°2o, в приведен в приложении к этой главе.
При этом следует помнить, что s°2o, в определяется не для «голой» макромолекулы, а для молекулы со связанными с ней противоионами и другими лигандами. Это обычно не проявляется в значительной степени. Если концентрация противоиона не влияет серьезным образом на форму или v (о чем упоминалось выше), в этом случае значение s°2o, в будет одинаковым, например, для 0,1 М и 1,0 М NaCl, а также для 0,1 М и 1,0 М CsCl. Однако в случае ДНК иногда это значение неодинаково для равных концентраций NaCl и CsCl, поскольку в одном случае получается Na-ДНК, а в другом — Cs-ДНК, которые имеют среднюю молекулярную массу нуклеотида 335 + 23 = 359 и 336+137 = 453 соответственно. (Средняя молекулярная масса нуклеотида составляет 336; Na и Cs имеют атомные массы 23 и 137 соответственно.) В обоих случаях s отражает действительную молекулярную массу, однако это заключение носит характер вероятного, что вытекает из того факта, что эмпирическое уравнение (6) было получено только для Na-ДНК. Это все справедливо и для белков, которые способны связывать катионы, анионы или и те и другие одновременно.
