Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Примеры использования скоростной седиментации
В приведенных ниже примерах скоростная седиментация используется для определения относительных количеств материала, имеющего различные значения s. Интересно отметить, что уверенные выводы делаются без необходимости знания точных значений действительного s.
Пример 11-В. Механизм инактивации бактериофагов при рентгеновском облучении. Если бактериофаги облучать рентгеновскими лучами, они теряют жизнеспособность. Возможным объяснением этого может служить расщепление ДНК фагов при облучении. Для изучения этого процесса фаги подвергали облучению, после чего отбирали пробы, получившие различные дозы, для определения жизнеспособности и анализа ДНК методом ультрацентрифугирования. На рис. 11-18, А изображены седиментаци-онные диаграммы двух ДНК фагов, получивших две различные дозы облучения. При увеличении дозы большая часть ДНК седи-
РИС. 11-18.
А — ссдиментограмма ДНК фага ВЗ Pseudomonas aeroginosa после двух доз рентгеновского облучения. Б — график зависимости доли интактных двойных цепей от времени рентгеновского облучения в сравнении с долей выживающих фагов. Для сравнения скоростей инактивации и разрывов цепей необходимо измерение относительных доз, что дает одинаковый уровень выживания.
1 — ДНК; 2 — фаг.
монтирует медленнее; это соответствует расщепленным молекулам. Фракция целых молекул определялась по методике, показанной на рис. 11-8. Сопоставление количеств целых молекул и доли выживающих фагов с дозой (рис. 11-18, Б) показывает, что гибель фагов протекает с большей скоростью, чем разрыв ДНК, причем ДНК разрывается со скоростью в 2 раза меньшей, чем гибнут фаги. Если облучение проводить в отсутствие кислорода (в атмосфере азота), фаги становятся более устойчивыми к облучению, хотя скорость расщепления ДИК остается прежней. Если построить график, показанный на рис. 11-18, ?, то можно установить, что скорость гибели становится равной скорости расщепления. Таким образом, этот простой анализ позволяет сделать заключение о двух типах гибели фагов: процессе, не зависящем от присутствия О2 и обусловленном только расщеплением ДНК, и процессе, который зависит от присутствия О2 и не включает расщепления ДНК.
Пример 11-Г. Связывание фермента с кофактором. Кофактор, восстановленный дифосфопиридиннуклеотидом (ДФН-Н), связывается с ферментом лактатдегидрогеназой (ЛДГ) из сердца цыпленка. Для понимания механизма действия фермента необходимо
м
N1
РИС. 11-19.
Седиментограммы различных смесей лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и кофер-мента восстановленного дифосфопиридиннуклеотида (ДФН-Н).
Поглощение регистрировали при помощи сканнера при длине волны 340 нм. Л —ДФН-Н без ЛДГ; 5—Д — ДФН-Н/ЛДГ—12, 8, 4 и 2 соответственно. Седиментация происходит слева направо: М и В — мениск и дно ячейки соответственно [Schachman И. К., Edel-stein S. J., Methods Enzymol., 27, 3—58 (1973)].
знать число центров связывания и константы диссоциации, характеризующие различные состояния равновесия. Иными словами, необходимо провести анализ связывания. Это можно осуществить с помощью ультрацентрифугирования. При использовании абсорбционной системы и света с длиной волны 340 нм (который поглощается ДФН-Н, но не ЛДГ) седиментацию можно применить для обнаружения ДФН-Н (рис, 11-19). Если присутствует только ДФН-Н, видна граница с s = 0,2. При добавлении ЛДГ появляется граница с 5 = 7 (значение, отвечающее чистой ЛДГ), Следовательно, ДФН-Н осаждается вместе с ЛДГ, т. е. связывается с ней, При возрастании количества ЛДГ можно измерять относительные количества ДФН-Н при s = 0,2 и $ = 7 и сделать из этого выводы о доле связывающегося кофермента. С помощью такого простого анализа можно определить зависимость отношения связанного к несвязанному ДФН-Н как функцию концентрации ДФН-Н и ЛДГ, pH, ионной силы и т. д.
Пример 11-Д. Индикация прочности пар оснований в ДНК-При обработке ДНК эндонуклеазой или облучении рентгеновскими лучами происходят разрывы единичных цепей. При накоплении таких разрывов в конце концов самые отдаленные разрывы двух отдельных цепей становятся достаточно близкими, чтобы получились разрывы двойной цепи, что приводит к фрагментации двухцепочечной ДНК. Так как прочность водородных связей зависит от температуры и ионной силы, можно ожидать, что минимальное разделение двух одноцепочечных разрывов, ко-
Доза,рай Доза, рай
РИС. 11-20.
Количество интактных единичных и двойных цепей ДНК фага ВЗ Pseudomonas aeroginosa после введения одноцепочечных разрывов при рентгеновском облучении.
Облученную ДНК седиментировали в щелочной (А) и нейтральной (Б) средах для изме-
{)ения количества одно- и двухцепочечных разрывов [Freifelder D., Trumbo В., Biopo-ymers, 7, 681—693 (1969)]. • высокая ионная сила; О низкая ионная сила.
торое не приводит к разрыву двойной цепи, также будет зависеть от этих параметров. Для определения одноцепочечных разрывов достаточно седиментации ДНК в щелочной среде, поскольку при больших pH двойная спираль расплетается с образованием двух отдельных полинуклеотидных цепей. Для изучения этого ДНК подвергали облучению рентгеновскими лучами и разрывы единичных и двойных цепей определяли седиментацией при щелочных и нейтральных pH (рис. 11-20). Доля нерасщепленных одно-и двухцепочечных молекул ДНК определялась для каждой дозы с использованием методики, показанной на рис. 11-8. Из относительно простого уравнения
