Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
h^[L{\-Fvb)!2b]--j,
где h — минимальное число пар оснований, необходимое для поддержания структуры; L — число нуклеотидов в одной цепочке; F — доля нерасщепленных двухцепочечных молекул и Ь — половина среднего числа разрывов на одну цепь, можно рассчитать минимальное число пар оснований, требующееся для поддержания двухцепочечной интактной молекулы. Нашли, что оно равно 2,6 и 15,8 в 0,01 и 1,0 М NaCl при 25°С соответственно.
РИС. 11-21.
Изучение диссоциации и ассоциации рибосом Е. coli по скорости седиментации.
На рисунке изображены шлиреновские седимеито-граммы рибосом при разных концентрациях Mg2+. А — в 0,01 М MgCla 70s рибосома стабильна; Б — в 0,0002 М MgCl2 она диссоциирует на одну 60s и одну 30s рибосомы (площади пиков относятся как 2:1. поскольку молекулярная масса 50s примерно в
2 раза больше, чем 30s); В — частичная реассоциация при переносе образца Б в 0,01 М MgCl2. При более высокой концентрации Mg2+ появляется пик 100s.
Мениск ------------> Дно ячейки
Пример 11-Е. Структура рибосом. Для рибосом, выделенных из бактерии Е. coli, найдено, что они состоят из четырех (как минимум) компонентов с 5 = 30, 50, 70 и 100 (рис. 11-21). С помощью седиментационного анализа можно показать, что эти компоненты представляют собой ассоциированные системы, зависящие от концентрации ионов Mg2+ причем частицы 30s и 50s объединяются с образованием частицы 70s, а две частицы 70s объединяются в частицу 100s. Это хорошо видно из рис. 11-21 по исчезновению пиков и возникновению их в новом месте, причем относительная площадь отражает концентрацию материала с каждым значением s.
Зональное центрифугирование в предварительно подготовленном градиенте плотности
В предыдущих разделах речь шла о методиках центрифугирования, в которых начальный раствор содержал макромолекулы с однородным распределением по ячейке, а вся информация получалась из наблюдения продвижения границ молекул при их седиментации в центрифужной пробирке. Хотя этот метод имеет множество достоинств и идеален для аналитического ультрацентрифугирования, неудобство его состоит в том, что молекулы с различными значениями s никогда не отделяются одна от другой, поскольку быстро осаждаемые молекулы движутся через раствор
в /
РИС. 11-22.
Последовательность операций в зональном центрифугировании.
А — получение градиента; Б — образец наносят тоиким слоем поверх градиента; В — пробирку помещают в ротор с подвесными стаканами к центрифугируют. Компоненты образца разделяются в соответствии с их значениями s; Г — в дне пробирки иглой прокалывают отверстие, после чего содержимое пробирки по каплям собирают в ряд пробирок. 1 — раствор с низкой плотностью; 2 — раствор с высокой плотностью; 3 — центрифужная пробирка; 4 — градиент концентрации; 5 — ротор.
медленно осаждаемых молекул. Отсюда возникают два эффекта: 1) концентрационная зависимость всегда приводит к ухудшению разрешения и 2) если быстро осаждаемый компонент можно физически отделить от медленно осаждаемого, первый из них всегда будет содержать примесь второго, причем степень загрязнения можно только понизить при повторной седиментации. Идеальный метод должен давать возможность каждому виду молекул седи-ментировать только через растворитель. К такой ситуации позволяет приблизиться зональное или полосовое центрифугирование. Приводимое здесь описание седиментации выполнено на препа-
РИС. 11-23.
Разделение двух компонентов методом зонального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (седиментация происходит справа налево).
А до Центрифугирования; Б и В — при последовательно увеличенном времени центрифугирования.
ративной центрифуге с использованием ротора с подвесными стаканами (рис. 11-5). Далее будет показано, как этот метод можно применить в аналитической центрифуге с использованием специальных ячеек.
Принцип метода зонального центрифугирования показан на рис. 11-22. Небольшой объем раствора, содержащего молекулы, которые следует охарактеризовать, наносят в виде слоя на раствор предварительно приготовленного градиента концентрации, находящегося в центрифужной пробирке. Наносимый раствор всегда имеет плотность, меньшую, чем плотность верхнего слоя градиента (в противном случае он будет погружаться в градиент). Затем пробирку центрифугируют, при этом молекулы исходного слоя седиментируют через градиент. Если все молекулы ймеют одинаковый коэффициент седиментации, то они будут се-диментировать в виде узкой зоны, как показано на рис. 11-23. Если же в образце присутствуют молекулы с различными коэффициентами седиментации, то в ходе седиментации они будут разделяться. Различные компоненты будут разрешаться в виде серии зон или полос, которые затем седиментируют только через растворитель отдельно одна от другой. После окончания центрифугирования содержимое пробирки фракционируют, чаще всего собирая фракции по каплям через отверстие в дне пробирки
РИС. 11-24.
Некоторые способы анализа зонального градиента, позволяющие получить распределение концентрации.
