Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
1пМ = 1пЛ4(с0) + kcQ, (17)
где М(с0) — значение М, измеренное при с0 (концентрация в центре зоны), k — константа, а Со рассчитывают из
где ci — начальная концентрация (перед центрифугированием), L — длина столба жидкости, а а — определяется из уравнения (16).
Читатель должен с большой осторожностью относиться ко всем измерениям молекулярной массы ДНК, выполненным методом равновесного центрифугирования в градиенте плотности до 1969 г., когда Шмид и Херст опубликовали свою работу. Однако в настоящее время этот метод и прямое измерение длины молекулы с помощью электронной микроскопии являются, вероятно, наиболее надежными способами определения молекулярной массы ДНК.
Все приведенные рассуждения справедливы только для материалов, которые гомогенны с точки зрения плотности. Гетерогенность по плотности обязательно будет приводить к уширению зоны за счет перекрывания множества близко расположенных зон. В результате получится искусственно завышенное значение а, что повлечет за собой заниженное значение молекулярной массы.
Определение плотности путем седиментации в градиенте плотности
Огромным достоинством равновесного центрифугирования в градиенте плотности является возможность разделения веществ в соответствии с их плотностью. Например, ДНК, содержащую изотоп 15N, можно отделить от 141М-ДНК. При седиментации до достижения равновесия в плотном растворе CsCl различие в плотности на 0,014 г/см3 приводит к разделению зон 14N- и 15N-ДНК на 0,5 мм в стандартной ячейке центрифуги при 40 000 об/мин. Другие изотопы позволяют достичь еще большего разрешения, что показано в табл. 11-1.
Ценность возможности разделения молекул ДИК на основании различий в плотности лучше всего видна из первого примера его использования Мэтью Мезельсоном и Франклином Шталем (метод был специально разработан для проведения этого эксперимента).
Пример. 11-П. Эксперимент Мезельсона — Шталя, показывающий полуконсервативный характер репликации. Бактерию в течение многих поколений выращивали в среде, содержащей 15N, после чего клетки переносили в среду, содержащую 14N, и выра-
ТАБЛИЦА 11-1
Увеличение плотности в растворе CsC] для ДНК, содержащей различные изотопы или замещенные основания
Изотоп * Увеличение плотности, г/сма
16N (100%)................ 0,016
13С (100%)................ 0,049
13С (60%)................ 0,030
2Н (95%) ................ 0,056
«N, 2Н (95%, 95%)........... 0,072
“N, 13С (95%, 60%)........... 0,046
Замещенное основание 5-бромурацил (100%) 0,119
* Число в скобках означает процент замещения нормального изотопа.
щивали еще в течение двух поколений. Через различные промежутки времени из культуры выделяли образцы ДНК и анализировали в градиенте плотности CsCl. Приросте бактерии плотность выделяемой ДНК вначале сдвигалась до значения, соответствующего равному содержанию обоих изотопов (она называется гибридной плотностью), а затем появлялась зона, соответствующая плотности 14Ы-ДНК (рис. 11-41). Сдвиг плотности в зависимости от числа поколений дал ясное указание на то, что ДНК имеет четное число субъединиц и репликация происходит полу-консервативпо (т. е. интактными остаются единичные цепи, но не двойные).
Приведем и другие пути использования изотопной метки для изучения репликации.
Пример 11-Р. Выделение реплицирующих молекул ДНК. Эта элегантная процедура была использована Юн-ичи Томизава и Хидеюки Огава для выделения интактных реплицирующих молекул ДНК. Фаг % Е. coli, содержащий природные изотопы *Н и
14N, использовали для инфицирования бактерий в питательной среде, содержащей 2Н и 15N. Через короткое время инфицированные клетки отделяли. Вся бактериальная ДНК имела 2HI5N-плотность, однако при полной репликации Х-ДНК можно было ожидать, что плотность ее будет соответствовать плотности одной цепи с 2Н151Ч-ДНК и другой —с 1H14N-flHK, как в примере 11-П. Если же А.-ДНК реплицирует лишь частично, плотность ее в таком случае должна немного повыситься. С помощью центрифугирования ДНК, выделенной из клеток после заражения, и отделения фракций ДНК с небольшим сдвигом плотности от нереплицирующей Я-ДНК были получены частично реплициро-
ванные молекулы. При исследовании этой фракции методом
Число поколении
15 14
14 15
15 14 14 14
14 14 К 15
РИС. 11-41.
Типичные данные, полученные в эксперименте Мезельсона—Шталя [Ргос. Nat. Acad. Sci., 44, 671—682 (1958)].
Е. coli в течение многих поколений выращивали в среде с 15N, а затем мгновенно переносили в среду с i4N. После одного поколения вся ДНК имела гибридную плотность. До первого поколения не было замечено ДНК с плотностью, меньше гибридной, поскольку во время выделения хромосома расщепляется приблизительно на 250 фрагментов. Справа показано состояние выделенной в различное время ДНК.
