Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 11-34.
Обнаружение коротких одноцепочечных фрагментов ДНК в Е. coli с помощью седиментации в щелочной сахарозе.
А — бактерию выращивали в течение многих поколений в присутствии 3Н-тимиднна; Б — метка вводилась в бактерию коротким импульсом; В — за коротким импульсом введения метки следовал период роста в отсутствие метки (детали приведены в тексте). Обратите внимание на различия в шкале значений радиоактивности между частью А и частями Б и В (данные получены в лаборатории университета Брандейс).
простые результаты привели к выводу, что ДНК синтезируется вначале в виде небольших фрагментов, которые затем объединяются в крупные единицы.
Пример 11-М. Обнаружение радиационных повреждений в бактериальной ДНК. При обработке меченной 3Н-тимидином бактерии ферментом лизоцимом, который разрушает часть клеточной стенки бактерии, и быстром нанесении полученного препарата на щелочной градиент сахарозы лизис бактерии будет завершаться при действии щелочи, а ДНК при этом будет денатурировать. Последующее центрифугирование показывает, что большая часть ДНК имеет очень высокий s (рис. 11-35). Если же перед лизисом клетки подвергнуть рентгеновскому облучению, значение s существенно понижается, указывая тем самым на то, что облучение приводит к одноцепочечным разрывам. Из эмпирического соотношения между s и М можно рассчитать число одноцепочечных разрывов и сравнить его с дозой радиации. Этот подход позволяет установить связь между разрывами цепей и убивающим действием рентгеновских лучей.
Пример 11-Н. Определение структуры ДНК фактора F Е. colL Фактор F Е. coli ответствен за способность мужского штамма переносить его ДНК к женскому штамму. Физическими метода-
РИС. 11-35.
Обнаружение одноцепочечных разрывов в ДНК Е. coli методом Ричарда Мак-Грата и Р. В. Вильямса [Nature, 212, 534—535 (1966)].
А — необлученная бактерия; Б — бактерия, облученная рентгеновскими лучами. Клетки обрабатывали лизоцимом и наносили слоем на щелочной градиент сахарозы. Лизис и высвобождение ДНК происходит в слое (данные получены в лаборатории университета Брандейс),
РИС. 11-36.
Обнаружение ковалентных колец
ДНК фактора F Е. coli.
Бактерию выращивали в присутствии 3Н-тимидина, подвергали лизису и седименти-ровали через щелочной градиент сахарозы. Сверхспирали фактора F составляют приблизительно 1% от общего количества ДНК, однако они легко отделяются вследствие высокого значения s в щелочи. / — фактор F; 2— хромосома.
Направление седиментации
ми анализа было установлено, что этот фактор является частью ДНК, отличающейся от ДНК хромосомы и составляющей всего лишь 1 % от молекулярной массы ДНК хромосомы. При выращивании мужского штамма Е. coli в течение многих поколений в среде, содержащей 3Н-тимидин, метка включается во всю ДНК. Если эти клетки затем подвергнуть лизису, после чего проанализировать ДНК методом седиментации в щелочной сахарозе, можно заметить небольшую (примерно 1% от общего количества ДНК) фракцию, которая седиментирует заметно быстрее (рис. 11-36), причем ее значение s больше, чем для интактной хромосомальной ДНК Е. coli. Такая быстрая седиментация обычно указывает на ковалентную кольцевую структуру. Ранее упоминалось о свойстве ковалентных колец, содержащих одноцепочечный разрыв, превращаться в незамкнутые кольца, что позволяет разделить цепи в щелочи; в свою очередь, это приводит к более медленной седиментации. Хорошо известны некоторые агенты, вызывающие одноцепочечные разрывы; их применение приводит к исчезновению пика быстро седиментирующего компонента. Кинетика этого процесса имеет первый порядок, что ука-
Выживание
РИС. 11-37.
Влияние рентгеновского облучения на Е. coli, содержащую F'Lac.
Часть А показывает часть градиента сахарозы, содержащую ковалентные кольца F'Lac для трех различных доз облучения. Часть Б показывает полулогарифмическую зависимость «выживания» ковалентных колец F'Lac; «выживание» определяли из анализа градиента, как в части А. Пэ7 — доза, при которой «выживание» составляет 1/е, т. е. 37%. При этой дозе происходит в среднем один одноцепочечный разрыв на молекулу F'Lac.
зывает на то, что причиной исчезновения пика является одноцепочечный разрыв. Таким образом, можно заключить, что F представляет собой ковалентное кольцо. Из эмпирического соотношения между s и М для ковалентных колец в щелочи можно получить значение М.
Пример 11-0. Измерение скорости образования одноцепочечных разрывов с помощью измерения количества «выживающих» ковалентных колец. В примере ll-М одноцепочечные разрывы обнаруживались при расщеплении линейных молекул ДНК. Это же можно проделать более точно путем анализа ковалентных колец. В бактерию Е. coli, содержащую половой фактор F'Lac, вводили радиоактивную метку, облучали рентгеновскими лучами, а затем седиментировали в условиях, описанных в примере 11-Н. Количество «выживающих» ковалентных колец F'Lac как функцию полученной дозы радиации измеряли при помощи сравнения количества радиоактивности в быстро седиментирующей фракции. График зависимости логарифма «выживания» от дозы приведен на рис. 11-37. Поскольку график представляет собой прямую, доза, при которой «выживание» составляет l/е, отвечает в среднем получению одного одноцепочечного разрыва на ковалентное кольцо. Значение М для F'Lac известно, поэтому легко рассчитать число разрывов на единицу молекулярной массы в зависимости от дозы.
