Методы анализа молока и молочных продуктов - Инихов Г.С.
Скачать (прямая ссылка):
190
Нанесение первичных пятен и постановка хромато-грамм. Первичные пятна на старт хроматограммы наносят градуированной микропипеткой на 0,1—0,2 мл или тонким капилляром в следующем порядке:
сектор № 1 — водная вытяжка продукта, образец № 1 (Б капель) сектор № 2 — водяная вытяжка продукта, образец № 2 (9 капель) сектор № 3— водные растворы аминокислот (свидетелей по капле каждого в один сектор)
Рядом с номером сектора с краю (участок между г2 и I3) отмечают графитным карандашом, какой образец и сколько капель нанесены в каждый сектор. Стартовые пятна не должны расплываться. Следующее пятно наносят в то же место, что и высохшее предыдущее. Диаметр суммарного подсохшего пятна не должен превышать 3 мм.
После нанесения стартовых пятен хроматограмму с фитилем в центре закрывают в хроматографической камере. Фитиль должен быть опущен в растворитель. Края круговой хроматограммы (по А. Бояркину) должны выступать наружу с тем, чтобы обеспечить известное испарение растворителя, способствующее его току от центра хроматограммы к ее периферии. Продолжительность хро-матографирования зависит от плотности бумаги, ширины фитиля, температуры, а также сложности аминокислотного состава образца.
Проявление хроматограммы. После надлежащей экспозиции в хроматографической камере хроматограммы подсушивают при температуре 18—200C и они освобождаются от остатков растворителя. Проявляют хроматограммы изатином с отбеливанием силикатом натрия. Их смазывают кисточкой или ватой спиртовым раствором изатина (I г изатина на 100 мм спирта с 1 мл ледяной уксусной кислоты). Хроматограммы нагревают в сушильном шкафу при 100—1050C (лучше всего между двумя чистыми стеклами) до проявления, отбеливают, смаеывая силикатным клеем (реактив 149) и подсушивают.
Для идентификации отдельных аминокислот для описанного выше растворителя и способа проявления изатином порядок расположения аминокислот на хромато-граммах приведен на стр. 183.
191
АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Адсорбционная хроматография основана на разделении составных частей раствора в колонке адсорбентом. Адсорбировавшиеся вещества из колонки извлекают чаще путем вымывания (элюатный способ). Летучие жирные кислоты разделяются на колонке (рис. 73) из силикагеля. В качестве неподвижной фазы применяют буферные растворы фосфорнокислых солей калия (К2НРО4 и К3РО4), а в качестве подвижной— хлороформ и 15%-ный раствор «-бутилового спирта в хлороформе.
В качестве адсорбента для разделения летучих жирных кислот используют жидкое техническое стекло, которое разводят тремя объемами воды (50°С). Полученный в воде раствор пропускают через бумажный фильтр (фильтрат должен быть прозрачным и неокрашенным). Для удаления ионов Al+++ и Fe+++, фильтрат обрабатывается 10 н. HCl, вливая ее тонкой струйкой (до появления слабо-розовой окраски в присутствии индикатора тимола голубого). Затем добавляют еще немного 10 н. PICl до покрытия поверхности образовавшегося геля.
Тщательно перемешав и растерев образовавшиеся комки, смесь оставляют в покое на 15—16 ч при температуре 18—20°С. Отстоявшуюся над гелем жидкость сливают, а осадок отфильтровывают через воронку Бюхнера или обычную воронку с полотняным ф.ильтром, применяя водоструйный насос. Затем отмывают водой до исчезновения реакции на ионы Cl (проба с AgNO3). Жидкость, тщательно отсасывают, осадок заливают 5 н. HCl и оставляют в покое на 24 ч. Осадок вновь отмывают водой до исчезновения реакции на ноны Cl" и высушивают до постоянной массы. Приготовленный адсорбент не обладает хорошими и устойчивыми адсорбционными свойствами. Его оставляют на 2 недели для стабилизации этих свойств, заливают
Рис. 73. Трубка для приготовления хрома-тографичс-ских колонок:
/— стеклянная бюретка; 2 — слой ачсорбен-та; 3 — бумажный фильтр; 4 — стеклянное сито; 5 — стеклянный кран.
192
10 и. HCl. Через 16—18 ч тщательно отмывают и высушивают, как описано выше. Готовый силикагель представляет собой легкий белый порошок. Обладая сильными гидрофильными свойствами, он поглощает влагу из воздуха, поэтому хранят его в сухом месте в плотно закрытой посуде. Перед употреблением высушивать до постоянной массы при 100—105° С.
В качестве буферных растворов используют 2 M растворы фосфорнокислых калиевых солей К2НРО4 и К3РО4 в разных соотношениях. Летучие кислоты молочного жира разделяют на колонке силикагеля с pH 7,2—7,3. Соотношение растворов фосфорнокислых солей для получения колонки с указанным pH устанавливают для каждой приготовленной партии силикагеля отдельно. pH силикагеля с буферным раствором измеряют на pH-метре стеклянным электродом. Берут 2 г адсорбента, добавляют 1,2 мл буферного раствора и около 20 мл воды.
Силикагель можно использовать повторно, его промывают водой (10—12 раз), просушивают при 150 -100° С.
Определение летучих жирных кислот в молочном жире
(по В. Аристовой и А. Карышевои)
*
Выделение летучих жирных кислот. Летучие жирные кислоты получают омылением жира щелочью с последующим разложением мыла серной кислотой и перегонкой образовавшихся летучих жирных кислот. Растворимые в воде кислоты перегоняются с водяным паром, а нерастворимые — с парами этилового спирта.
