Методы анализа молока и молочных продуктов - Инихов Г.С.
Скачать (прямая ссылка):
1 Оптимальные концентрации аминокислот, при которых сохраняется линейная зависимость между концентрацией и окраской, находятся в пределах 2,5—12,5 мкг.
184
Таблица 25
Аминокислоты, показанные фотоэдектроколсрнметром
Количест- • о
во аминокислоты, S3 E CCS к S E E S * « к 63 E E E E
MKZ t: и н с E CJ а
со т ч I- ь. E со
2,5 0,03 0,02 0,08 0,0(5 0,04
3,5 0,04 0,03 — 0,10 .— 0,06 0,07
4,5 0,05 0,04 0,05 0,13 — 0,07 0,09
5,0 — — .— — 0,12 —
5,5 0,06 0,05 0,07 0,15 — 0,09 0,11
6,5 0,07 0,06 — 0,17 — 0,11 0,13
7,5 — —- 0,11 — 0,14 —
9,5 — — 0,14 — — - —
10,0 — — — — 0,19 - —
12,5 — — — — 0,24 - —
Иногда растворитель, пропускаемый по фильтровальной бумаге, дает не резко разграниченные пятна отдельных веществ, а слившиеся вместе. Это происходит, когда один растворитель не разделяет все компоненты данного раствора. В этих случаях применяют не один, а последовательно два различных растворителя, основываясь на том, что коэффициент скорости перемещения каждого вещества (Rf) зависит от состава растворителя и, таким образом, слившиеся пятна могут быть разделены. Отсюда хроматограммы на бумаге бывают одномерные, когда применяют один растворитель,, и двухмерные при использовании двух растворителей, которые обусловливают более полное разделение вещества на составляющие его компоненты.
На одномерной хроматограмме пятна веществ располагаются по вертикали (рис. 70). Растворитель может проводиться сверху вниз (нисходящая хроматограмма) или снизу вверх (восходящая хроматограмма). Нисходящая хроматограмма показывает больший коэффициент скорости (Rf), но пятна получаются более расплывчатыми. При восходящей хроматограмме капля исследуемого вещества находится внизу и оттуда же растворитель под влиянием капиллярных сил поднимается вверх — пятна распределенных веществ более компактны, но коэффициент скорости меньше. При восходящей хроматограмме очень важно постоянство концентрации растворителя, что
185
достигается герметичностью хроматографическои камеры.
Двухмерные хроматограммы отличаются иным расположением пятен веществ (рис. < 71), так как растворители про-
пускают в двух направлениях: первого в вертикальном, второго в горизонтальном.
Квадратный (примерно 60X60 см2) лист хроматографическои бумаги требует соответствующих камер и более длинных ванн с растворителями. Исследуемый раствор в количестве в 2 -3 раза больше, чем при одномерной хроматографии, наносят капиллярной пипеткой в левый верхний угол предварительно обработанной бумаги на расстояние 5 7 см от обоих краев листа.
Внесенный раствор на листе подсушивают, фильтровальный лист закрепляют в ванночке с первым растворителем. После окончания распределения хроматограмму снимают, Щ 9 - j хорошо высушивают и вновь
закрепляют в другую ванночку со вторым растворителем, повернув лист на 90е по отношению к первому положению. По окончании хроматографи-рования лист просушивают и далее поступают как при одномерном хроматографирова-нии.
Рис. 70. Хроматограммы свободных аминокислот:
/ — лизин; Ї - гистидми; 3 — аргинин; 4 — аспарагиновая
кислота; 5 — серии; 6 — глицин; 7 — глюгамнновая кислота; 8 — треонин; 9 — ала-
нин; 10 - тирозин; 11 — Пронин; 12 иенндентифнцнре-вано; 13 - метионин; 14 еалнн; 15 — фенилаланин; 16 — лепцнн + изоленцнн.
Определение свободных аминокислот в молоке и сырах
Метод Мартини и Сейджема. Метод был приспособлен к исследованию сыра и молока П. Кугеневым. Отвешивают 2,5 г средней пробы сыра. Навеску переносят в
186
фарфоровую ступку, тщательно растирают с небольшим количеством воды (около 30 мл). Затем помещают в колбу на 50 мл, фарфоровую ступку несколько раз ополаскивают водой, сливая ее в ту же колбу, хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике на 10—12 ч. Застывший жир узкой металлической ложечкой осторожно удаляют из колбы, содержимое ее подогревают до 200C и доводят водой до метки* Жидкость фильтруют через плотный фильтр и к 25 мл фильтрата добавляют 125 мл 96%-ного этилового спирта для осаждения белков.
Спиртовую смесь оставляют на холоду на 17 24 ч до осаждения образовавшихся хлопьев и полной прозрачности жидкости над осадком. Жидкость фильтруют через плотный фильтр, отмеривают 75 мл раствора (соответствует 0,625 г сыра), переносят в фарфоровую чашку и выпаривают под вакуумом на водяной бане при 30—400C досуха. К сухому остатку добавляют для несозревших сыров точно I мл воды, а для созревших—1,5 мл, тщательно перемешивают.
1I / © t
|| А* «§ к
55 _
*Q *< I ^ л » л" Направление дВиікениящ % " (ррента второго растборителя
^S1
Рис. 71. Двухмерная хроматограмма.
Полученный раствор фильтруют через маленький фильтр в небольшую пробирку или колбочку, закрывают пробкой и ставят в холодильник. Если раствор для определения аминокислот сразу не используется, то можно добавить одну каплю хлороформа (0,05 мл), учтя в дальнейшем изменение объема жидкости.
187
Хроматографию проводят как для аминокислотного состава белков молока. Количество раствора аминокислот, вводимых на хроматографическую бумагу, зависит от степени созревания сыра и вида его. Для молодого голландского и кубанского сыров количество раствора колеблется в пределах 30—-50 мкг, для зрелого голландского и ярославского — от 20 до 40 мкг, а для кубанского— 15 —30 мкг щ
