Методы анализа молока и молочных продуктов - Инихов Г.С.
Скачать (прямая ссылка):
J — стеклянный сосуд; 2 — ванночка; 3 — крышка; 4 — бумажная поломка; S — чашка с водой и растворителем.
Рік?. 69. Ванночка для бумажной хроматографии.
представляет собой трубку, запаянную на концах. По длине ванночки располагается щель, в которую при исследовании вставляют верхний край бумаги и кладут предметное стекло, удерживающее бумагу в ванночке.
Определение аминокислотного состава белков молока
Аминокислотный состав белков молока определяют по методу Боде, уточненному П. Кугеневым и М. Медведевой.
Выделение белков молока и подготовка их к анализу.
Среднюю пробу исследуемого молока 2—3 раза сепарируют, чтобы в нем оставалось не более 0,1 % жира. За-
179
тем 300 мл молока разбавляют водой (1 :3), осаждают казеин 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отстоявшуюся прозрачную сыворотку осторожно декантируют и фильтруют в колбу.
Казеин, собранный на фильтре, переносят в ступку, растирают с водой, декантируют в колбу с сывороткой. Прибавляют воду и растирают казеин, сливая воду в ту же колбу еще два раза. Последний раз на фильтр перекосят весь казеин. Подставив под воронку с казеином коническую колбу, его растворяют на фильтре в возможно меньшем объеме 0,1 н. раствора ¦NaOH. Фильтр промывают водой, сливая ее в раствор казеина. В раствор в колбе прибавляют 50%-ный раствор уксусной кислоты до выпадения казеина в осадок. Осадок промывают на фильтре водой, растворяют и осаждают казеин не менее трех раз. Затем промывают казеин, 3 раза растирают в ступке с ацетоном для подсушивания и 3 раза — с серым эфиром для отбеливания.
Для выделения альбумина и глобулина отфильтрованную сыворотку с промывными водами после осаждения казеина нагревают до 90° С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Осадок отфильтровывают, промывают водой и переосаждают. Полученные препараты белков— казеин и смесь альбумина и глобулина — высушивают при комнатной температуре до воздушносухого состояния, измельчают (возможно тоньше) и хранят в банках с притертыми пробками на холоду.
Для определения общего количества белков молока на 1 объем обезжиренного молока добавляют 4 объема 18%-hoiо раствора трихлоруксусной кислоты. Через 1 ч выпавший осадок отфильтровывают и промывают водой до pH воды ниже 4,5—5,0. Осадок подсушивают ацетоном, трехкратно обезжиривают диэтиловым эфиром.
Гидролиз. Для гидролиза на аналитических весах отвешивают около 1 г полученных белков в широкую пробирку и заливают 20 мл 20%-ного раствора HCl. Гидролиз проводят в автоклаве в течение 4 ч при давлении 3 атм. Охлажденный гидролизат, окрашенный в бурый цвет, разбавляют двойным объемом воды и фильтруют через складчатый фильтр в колбу для освобождения от гуминовых веществ. Осадок на фильтре промывают водой, сливая ее в ту же колбу до тех пор, пока стекающий фильтрат не станет бесцветным.
180
Соляную кислоту удаляют отгонкой под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом на водяной бане при GO—70° С. В отгонную колбу гидролизат вносят небольшими порциями и, когда он выпарится до густой консистенции, промывают водой (10 12 мл), приливая ее и отгоняя не менее 5 раз. Остаток небольшими порциями воды (3 мл) переносят в мерную колбу на 25 мл.
Хроматография на бумаге. Бумагу разрезают на полоски примерно по 20X45 см. Верхний конец листа опускают в ванночку с растворителем.
Растворы на бумагу наносят калиброванными.микропипетками объемом не более 0,003 мл. Большое количество раствора повторно наносят на одну и ту же точку. После нанесения на точку каждой порции раствора пятно высушивают. На расстоянии 5—7 см от узкого края листа бумаги проводят прямую линию, на которой определяют точки нанесения исследуемого раствора (расстояние между точками не менее 3 см). С одной стороны оставляют свободную полосу шириной в 5 см, из которой вырезают участки для холостых проб.
Растворитель, перемещаясь по фильтровальной бумаге, захватывает вещества ив нанесенных капель исследуемого раствора и, протекая через неподвижную водную фазу на бумаге, избирательно распределяет их по пути движения.
Движение веществ строго закономерно и определяется их структурой и составом растворителя.
Коэффициент скорости перемещения веществ на фильтровальной бумаге обозначается символом Rf, выражающим отношение расстояния оседания данного вещества (центра пятна) от точки нанесения исследуемого раствора на фильтровальную бумагу к расстоянию от той же точки до линии продвижения растворителя. Коэффициент скорости передвижения каждого вещества при определенной температуре для данной бумаги и растворителя является величиной постоянной. В условиях методики получают относительно устойчивую хроматограмму, которой можно пользоваться как ориентировочной (табл. 23).
Хорошим растворителем для аминокислот является смесь n-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1, причем лучшие результаты получают при 3—4-кратном пропускании растворителя по
181
Таблица 23
Аминокислоты Rf Аминокислоты Rf
0,08 0,44
0,13 0,52
Гистидин ..... 0,15 0,57
Аргинин....... 0,17 Тирозин ........ 0,59
