Методы анализа молока и молочных продуктов - Инихов Г.С.
Скачать (прямая ссылка):
Для относительной количественной оценки содержания отдельных фракций простым карандашом разбивают электрофореграмму линиями, параллельными стартовой черте, на полоски по 0,5 см шириной. Проставляют на полосках порядковые номера и разрезают электрофореграмму по линиям. Полоски помещают в сухие пробирки, записывая на них номер полоски. Приливают в пробирки по 3 мл 0,01 п. раствора NaOH. Через каждые
15 мин жидкость в пробирках перемешивают, закрыв их пробками и несколько раз перевертывая. Раствор окрашивается в синий цвет.
Через 1 ч приступают к фотометрированию растворов на приборе типа ФЭК-М в кюветах 30 мм с зеленым светофильтром при длине волны 620 нм. Данные показаний об относительном содержании красителя в различных полосках бумаги, пропорциональные количеству белковых фракций, представляют графически столбчатой диаграммой, в которой слева направо по порядку номеров располагают столбики, соответствующие отдельным полоскам бумаги. Высота этих столбиков в определенном масштабе соответствует найденному фотометрически содержанию красителя в каждой полоске.
176
Для более наглядного изображения результатов вершины столбиков соединяют непрерывной линией. Для количественной оценки содержания отдельных фракций суммируются высота всех столбиков, относящихся к одной н той же фракции. При этом высота столбиков, лежащая на границе двух различных фракций, делится для подсчета пополам: одна половина относится к одной фракции, другая — к другой.
При разбивке электрофореграммы на полоски обязательно включаются и полоски, заведомо не содержащие белка. Результаты колориметрирования показывают, что эти полоски оказываются слегка окрашенными. Высота столбиков, относящихся к таким полоскам, не содержащим белка, усредняется. Принимается, что она соответствует отсутствию белка, поэтому высота всех остальных столбиков отсчитывается от этого нулевого значения. На рис. 67 приведена типичная электрофореграмма и элект-рофоретические кривые ка-зеина.
г
Рис. 67. Электрофорс-грамма (и) и электрофо-ретические кривые (б) казеина:
о 1 — а-казеии; 2 — ?-казеиіі;
3 —Y-казсші.
Исследование сывороточных белков
Обезжиренное молоко (0,5 л) нагревают до 400C и казеин осаждают 1 н. раствором уксусной кислоты. Отстоявшуюся сыворотку фильтруют через бумажный складчатый фильтр и нейтрализуют 1 н. раствором аммиака до pH 6,5 (по индикаторной бумажке). Добавляют на 100 мл сыворотки 70 г сухого кристаллического сернокислого аммония, тщательно перемешивают до полного растворения его. Осажденные белки отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр.
Оставшийся на фильтре белковый слой снимают осторожно шпателем и переносят в целлофановый мешочек, который погружают в стакан с дистиллированной
177
водой и помещают в холодильник при температуре 8 — 10° С. Диализ против дистиллированной воды проводят 24 ч при частой смене ее и 24 ч против вероналового буфера (ионная сила 0,1, pH 8,5), но не содержащего мочевины (реактив 86). Диализ можно проводить только против дистиллированной воды. В мешочке образуется раствор сывороточных белков. Его фильтруют через бактериальный фильтр Зейца и подвергают электрофорезу на бумаге, как раствор казеина.
На основании колориметрических исследований отдельных фракций белков в казеине и сыворотке молока устанавливают количественное соотношение между ними в молоке или сыворотке. Если показания оптической плотности при колориметрировании фореграммы казеина молока составляют для о-казеина 0,50, ?-казеина 0,83, у-казеина 0,08, то относительное соотношение их находят по формуле
где а— показание по фотоколориметру оптической плотности каждой фракции отдельно; б — сумма показаний всех фракций.
ХРОМАТОГРАФ ИЯ
Для разделения и очистки смесей веществ адсорбционными методами используют хроматографический анализ. Раствор веществ или газ приводятся в соприкосновение с поглотителем (адсорбентом), извлекающим из смеси те или иные компоненты. Пользуясь различной избирательной способностью адсорбента, можно очистить вешество от посторонних примесей или разделить составные части смеси. Различают распределительную, адсорбционную, осадочную, ионообменную, газовую и тонкослойную хроматографию.
РАСПРЕДЕЛИТЕЛЬНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
В молочной промышленности используют распределительную хроматографию на бумаге. Распределение происходит между двумя смешивающими жидкими растворителями (фазами), из которых один неподвижный,
178
обладающий адсорбционными свойствами, находится на неподвижной основе, и второй — подвижный, захватывающий исследуемые вещества смеси. Неподвижной фазой является вода, всегда присутствующая на фильтровальной бумаге (специальной), а подвижной — органический растворитель.
Фильтровальную бумагу предварительно обрабатывают для удаления следов металлов (раствором 8-оксино-лина) и промывают растворителем. Хроматографическая камера приведена на рис. 68. В раструб камеры помещают рамку, изготовленную из стеклянных палочек, в которую впаяна стеклянная ванночка 2. Ванночка (рис. 69)
Рис. 68. Реакционная камера для бумажной хроматографии:
