Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 75

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 106 >> Следующая

3) Как отмечалось выше для табл. 1, количественные выражения содержат полную концентрацию распределяемого вещества ша, растворенного в подвижной фазе. Поэтому фронтальная хроматография имеет преимущество перед обычным зональным процессом.
Фронтальная хроматография отличается от зонального варианта лишь объемом раствора, вводимого на колонку. На колонку вводится объем раствора, достаточный для того, чтобы профиль элюирования содержал участок плато, в котором концентрации всех растворенных реагентов равны их концентрациям во вводимом растворе. Как и в зональном методе, рекомендуется элюирование буфером. Полученные таким образом кривые элюирования представляют собой комбинацию двух участков: начального участка (восходящий профиль), отражающего увеличение концентраций всех растворенных компонентов от нуля до концентраций наносимой на колонку смеси, и конечного участка (нисходящий профиль), соответствующего уменьшению концентраций всех компонентов от значения плато до нуля. В количественной аффинной хроматографии, где обычно используются процессы связывания, происходящие количественно, т. е. специфично для суммарной концентрации растворенного вещества, объем элюирования Va может быть получен как среднее значение сечения (центроида) [29] начального или конечного участка кривой элюирования. Положение этого сечения определяется математическим выражением
Уа=~^г f VdmA^^-i:VAmA (1)
тГ д j т а
о
где V — средний объем элюата, соответствующий увеличению концентрации растворенного вещества АтА, а пределы суммирования (интегрирования) соответствуют координатам при гпа=>0 и первоначальной концентрации растворенных компонентов на прямолинейном участке кривой (плато, mA = raAa). Более удобны для расчета Va по результатам экспериментов, в которых колоночный элюат собирается по фракциям, следующие выражения:
Для начального участка у „ _ кривой элюирования А т
Для конечного участка у кривой элюирования А
V'-^mAAV
\ О
(2а)
Характеристика взаимодействий
199
гпа — суммарное содержание растворенного вещества во фракции объемом AV, V— объем элюата на участке кривой, соответствующей исходному составу (где /пА = /пАа), а V" — объем элюата на участке, соответствующем растворителю (тА = 0) на конечном участке кривой элюирования. На восходящем участке профиля элюирования начало измерения объема совпадает с началом нанесения образца, в то время как конечный участок элюирования начинается после повторного введения растворителя на колонку. Следует отметить, что единственный фронтальный эксперимент дает два независимых определения объема элюата Va, при котором концентрация растворенного .вещества составляет половину ее значения на участке плато при условии симметричности начального и конечного участков кривой.
Зональный метод количественной аффинной хроматографии [1, 2, 5] в настоящее время пользуется большей популярностью, чем фронтальный, главным образом из-за применения в последнем методе слишком большого количества растворенного вещества. Однако различия в требуемом количестве растворенного вещества не так велики, как может показаться на первый взгляд. Хотя в случае фронтального эксперимента объем вводимого раствора гораздо больше, концентрация может быть значительно ниже ввиду отсутствия далее в работе какого бы то ни было разбавления. Это положение становится совершенно очевидным из рис 1, на котором представлены восходящие профили элюирования при различных концентрациях NADH при фронтальной аффинной хроматографии лактатдегидрогеназы печени крысы на колонке объемом 0,1 мл (0,08x5,0 см) с 10-карбокси-дециламино-сефарозой в сравнении с соответствующими профилями, полученными при зональной хроматографии на колонке с тем же аффинным адсорбентом, объем которой в 10 раз больше (0,50X1,28 см) [20].
Количество лактатдегидрогеназы, использованной для получения фронтальных профилей (рис, 1,а) и, следовательно, двух значений Va, в каждом случае варьирует от 9 до 54 пкмоль (1— 6 мл 9 нМ раствора фермента) по сравнению с 18 пкмоль фермента (0,1 мл, 180 нМ) для каждого зонального эксперимента (рис. 1,6). Следует также заметить, что в то время как фронтальные кривые дают возможность точного проведения среднего сечения независимо от изучаемой концентрации NADH, локализация эквивалентного положения в зональных профилях (рис. 1,6) становится все более трудной по мере уменьшения концентрации лиганда. В заключение следует отметить, что, хотя зональный метод более экономичен в отношении количества растворенного вещества, результаты, полученные этим методом, трудно интерпретировать без введения определенных упрощающих допущений. Упомянутое выше исследование биоспецифической десорбции лактатдегидрогеназы с 10-карбоксидециламино-
14*
200
Глава 6
Объем элюента,мл Объем элюента.мл
Рис. 1. Сравнение влияния концентрации NADH на кривые элюирования при фронтальной и зональной хроматографии лактатдегидрогеназы печени крысы на 10-карбоксидециламино-сефарозе. а — начальные участки кривых элюирования, полученные при фронтальной хроматографии фермента (9 нМ) на колонке (0,1 мл) в отсутствие NADH (/) и в присутствии 2 (2), 3 (<?), 4 (4), 5 (5) и 6 мкмоль/л (6) кофермента; б—кривые элюирования, полученные при зональной хроматографии фермента (0,1 мл, 0,18 мкМ) на колонке (1,0 мл) в присутствии 8 (l)t 10 (2), 12 (3), 15 (4) и 18 мкмоль/л (5) NADH [20]. (Воспроизведено с разрешения.)
Предыдущая << 1 .. 69 70 71 72 73 74 < 75 > 76 77 78 79 80 81 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed