Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Характеристика взаимодействий
193
2. ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВЫРАЖЕНИЯ
Первоначально количественная аффинная хроматография ограничивалась определением констант ассоциации для систем, в которых распределяющееся вещество А, находящееся в растворе, имело только одно положение для взаимодействия с X и/или S, но последующее развитие метода [17—19] дало возможность учитывать и мультивалентность растворенного вещества. Существующая теория, однако, ограничена или системами, в которых не происходит распределения растворенного вещества по гелю, или системами с достаточно небольшим лигандом, что позволяет считать хроматографические распределительные характеристики для А и всех АЭгКОмплексов очень близкими. Первый отмеченный случай, вероятно, наблюдается, когда и растворенное вещество и лиганд — макромолекулярные соединения; при этом можно выбрать подходящий аффинный адсорбент, исключающий реагент большей молекулярной массы. Хотя теория мультивалентных растворенных веществ должна, разумеется, включать также и специальный случай одновалентного вещества, концепции количественной аффинной хроматографии легче понять при первоначальном рассмотрении простейших ситуаций.
2.1. Системы с одновалентным распределяющимся веществом
В исчерпывающем исследовании фронтального хроматогра-фического поведения аффинной системы, в которой растворенное вещество А имеет единственное положение для взаимодействия с X и S [3], рассматривались следующие равновесия, отражающие возможные взаимодействия в аффинной хроматографии:
Предполагается, что в этих выражениях молярная концентрация каждого равновесного компонента одинакова во всех частях колонки, доступных для этого ряда, причем лиганд X однородно распределен в том же самом объеме, что и А. Эти соотношения соответствуют общему случаю, когда в системе, подвергающейся аффинной хроматографии, присутствуют все равновесия; для реальных ситуаций аффинных экспериментов, когда три из пяти констант равновесия равны нулю, был введен ряд выражений [3], суммированных в табл. 1, причем Va — объем элюирования А в эксперименте, проведенном только с А
A + S < >• AS яід5 = KAS>mAms А + X AX шАХ = /Сах^а^х
X + S XS mxs = Kxs^x^s
А < > XSA mxsA ^xsa^a^s^x
X ч ^ ASX /rtASX = A^asx^a^s^x
13—139
194
Глава 6
при тех же концентрациях тА, к которым относится FA; а уА* — объем элюирования при отсутствии взаимодействия растворенного вещества с матрицей (в примерах 1 и 2 Fa=Fa*). Если же А взаимодействует с X (примеры 3 и 4), то этот объем элюирования для несвязавшегося растворенного вещества может быть получен или экстраполяцией результатов к бесконечно большой концентрации конкурирующего лиганда S, или проведением эксперимента с той же самой матрицей, не содержащей групп X [2, 3, 20]. В табл. 1 включены альтернативные выражения для этих двух случаев с использованием разности (Fa-Fa*) для систем, где Fa* более легко определяется, чем Fa ввиду слишком большого значения последнего. В ранних вариантах [3, 21] табл. 1 вместо Fa* в правые части уравнений входил объем стационарной фазы Fs, и таким образом объем, в котором находятся участки связывания матрицы, учитывался некорректно [22].
2.2* Системы с мультивалентным растворенным веществом
В случае когда распределяемое вещество содержит более одного положения для взаимодействия с участками связывания матрицы, приведенные выше химические равновесия остаются в силе, но необходимо рассмотреть дополнительные равновесия для образования комплексов АХ/, в которых одна молекула А образует поперечные связи между несколькими положениями матрицы. Первоначальные работы, рассматривавшие мультива-лентность растворенного вещества [3, 12], ограничивались ситуацией, при которой стерические трудности исключали такого рода мультивалентное связывание А с матрицей. В этих особых условиях полученные экспериментально в нескольких системах при очень низких значениях гпх [6, 14] зависимости, построенные в соответствии с отношениями, приведенными в табл. 1, линейны и дают &Ах— истинную константу ассоциации [23] или константу связывания [24] для взаимодействия между матрицей и распределяемыми растворенными компонентами (А или ASi). Однако использование аффинной колонки с более высокой концентрацией участков связывания на матрице приводит к отклонению указанных зависимостей от линейности [14, 17], что свидетельствует о несоблюдении принятого допущения об отсутствии мультивалентного связывания, находящегося в растворе вещества с матрицей.
Применение законов теории вероятности к числу реагирующих положений [25—27] привело [18, 19] к получению общего решения проблемы мультивалентности распределяющегося растворенного вещества для случаев, при которых несколько взаимодействий f-валентного AcX можно описать в терминах константы моновалентного связывания ?Ах. Первоначально [18,19]
Характеристика взаимодействий
195
Таблица 1. Системы аффинной хроматографии, в которых включение лиганда S в элюирующий буфер влияет на объем элюирования одновалентного растворенного вещества А. Зависимость объема элюирования от присутствия лиганда в случае действительного равновесия
