Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Пример
Истинные константы равновесия
Зависимость объема элюирования от концентрации лиганда
/(as, KaSX /(as, KaX
/(ax, Kxs
I
1
Va-V*a I
Va- V*a
Va-Va L
V*AmxKAsKA$xms _1_
V*AmxKxsKxsAms
О + Кахпа)*
I + KasxvJa V*AmxKAsx 1 + Kxsa^a V*AmxKxsA
___^ 1 + Кахгпа
V*a^xKaxKas^s V*AmxKAx _
1
Ка$ю$
+
I + K ax^a
Va
J_= _ Г (M
V*a"ixKax V*AmxKAX + Кахпа)2 , 1 + КахПа
1
Va- V*a
xKaxKxs^s V*AmxKAX . Kxsms I + ^AX^A
V* АтхКАх V*AmxKAX
Некоторые замечания к табл. 1.
1) Примеры 1 и 2 описывают аффинную хроматографическую систему, в которой величины Fa увеличиваются с увеличением концентрации лиганда, в то время как примеры 3 и 4 — случай конкурентного элюирования, когда увеличение ms приводит к уменьшению объема элюирования.
2) Точная интерпретация результатов эксперимента возможна при условии, что исследована также концентрационная зависимость объемов элюирования отдельных реагентов (А и S).
3) Наряду с использованием концентрационной зависимости Fa при фиксированной концентрации лиганда ms константы равновесия можно находить графически из зависимости 1/(Fa-Fa) от l/ms [или 1/(Va-Va*) от ms (примеры 3 и 4)]. Такой подход вытекает из соотношений, приведенных в табл. 1.
4) Во все соотношения входит суммарная концентрация растворенного вещества в жидкой фазе /йа, определение этой величины не вызывает проблем при фронтальной хроматографии, но она неизвестна и постоянно меняется в случае зональной хроматографии.
5) Теоретические отношения содержат также параметр тх — суммарная концентрация доступных положений связывания на матрице, величина которой может быть существенно меньше значения, установленного химическими анализом аффинной матрицы.
13*
Таблица 2. Системы аффинной хроматографии, в которых включение лиганда S в элюирующий буфер влияет на объем элюирования /-валентного растворенного вещества А
Пример Истинные константы равновесия Зависимость объема элюирования от концентрации лиганда
1 (l + *Asms)[I- (V*A/VA)Vf] ^ASX — ------- .......' (VA/VA)4f{mx-fmA (VA/V*A) [1 _ (V*A/VA)4f]} kASps
2 AXS, &XSA j, (l + *xsWs) [!-(^a/Ka)^] XSA (!"a/^a)1" Йс-Ma (Ka/K*a) (1-(VV^a)1/']} *xs»«s
3 ^AX (I + *as«s) ll-(V*A/VA)Vf] ft д X = _ _ _ (W^'k-^A (Ка/И*а) [1 - (V*a/Ka)^]}
4 &АХ» AXS (1 + ^s)[I-Wa)1"] «AX — ""'" — — — ч {V*AIVAylf{mx-fmA (VAIV*A) {1 - [V*A/VA)Vf]}
Характеристика взаимодействий
197
для экспериментов по распределительному равновесию были составлены^ выражения, куда вошли концентрации растворенного в жидкой^фазе вещества fhA и его суммарная концентрация в системе гпа- Эти выражения могут быть превращены в форму, лучше соответствующую экспериментам фронтальной хроматографии [22]; при этом Уа*7па=7агпа выражает необходимое условие сохранения массы. Из табл. 2, в которой приведены выражения для ситуаций, наблюдаемых при хроматографии одновалентных растворенных веществ, видно, что установление значения тх — общей эффективной концентрации положений связывания на матрице — необходимо для количественной оценки экспериментальных результатов в терминах двух истинных констант равновесия.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Принимая во внимание, что суммарная концентрация доступных положений матрицы тх должна быть рассчитана по экспериментальным данным, колоночная хроматография представляет собой простейший метод количественной аффинной хроматографии, поскольку найденное из эксперимента значение тх затем будет использоваться в расчетах других экспериментов, выполненных на той же колонке с тем же растворенным веществом. Однако в некоторых примерах, особенно в случае биологических аффинных матриц, таких, как миофибриллы мышц [28], колоночный метод нельзя использовать из-за проблем, связанных со скоростью потока, поэтому в количественной аффинной хроматографии находят применение также эксперименты распределительного равновесия.
3.1. Колоночная хроматография
Методика проведения количественной аффинной хроматографии не отличается существенно от обычного колоночного эксперимента, за исключением необходимости проведения экспериментов в сравнительно небольшом масштабе. Тем не менее следует принять во внимание следующие соображения.
1) Поскольку химическое равновесие зависит от температуры, следует использовать колонку с рубашкой, поддерживая требуемую температуру с помощью термостата.
2) Для расчета констант равновесия требуется точное определение объемов элюирования, поэтому следует обеспечить достаточную точность в измерении величин Fa- Если элюат собирается по фракциям для анализа, то количество каждой фракции можно наиболее точно определять по ее массе; с этой целью
14—139
198
Глава 6
рекомендуется собирать фракции в предварительно взвешенные пробирки. Можно также контролировать и замерять скорость потока в сочетании с постоянным контролем объема элюата.
