Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
сефарозы с помощью NADH [20] является вполне достаточным подтверждением того факта, что фронтальный метод может быть осуществлен с относительно небольшими количествами распределяемого растворенного вещества.
3.2. Эксперименты по распределительному равновесию
Вместо колоночной хроматографии можно провести серию экспериментов по распределительному равновесию, в которых для смесей с известной суммарной концентрацией тА концентрация растворенного вещества А в жидкой фазе гпа определяется непосредственно [3, 28]. При этом подходе смеси, содержащие известные количества матрицы и распределяющегося растворенного вещества (для наиболее точного определения их состава предпочтительно готовить смеси из навесок), выдерживают при определенной температуре до установления распределительного равновесия. Затем путем фильтрования [3] или центрифугирования [28] каждой смеси отделяют супернатант при той же температуре и определяют в нем содержание са, например ферментным анализом. Объемы Fa и Уа*> входящие в
Характеристика взаимодействий
201
соответствующие выражения табл. 1 и 2, могут быть затем получены из отношений Va^Ca = VaCa и FA = ayA/I/A*, где wA — масса распределяющегося растворенного вещества А, добавленного к суспензии, а УА* (объем, доступный для А) определяется из эксперимента, когда нет взаимодействия А с участками связывания матрицы, или из экспериментов с матрицей, не содержащей Х-групп [3, 20]. Любые различия в объемах стационарной Vs и жидкой V0 фаз при работе с различными смесями можно учесть, введя коэффициент распределения Kav* [30] и используя выражение УА* = Vo+Kav*V; объем жидкой фазы можно
термостат (200C)
Рис. 2. Схема установки для изучения рециркулирующего распределительного равновесия [31]. (Воспроизведено с разрешения.)
найти из данных эксперимента, при котором растворенное вещество не взаимодействует со стационарной фазой и не проникает в нее.
К недостатку описанных выше распределительных экспериментов относится необходимость точного определения массы и, следовательно V5 [3], аффинной матрицы в каждой реакционной смеси. Хотя это требование не создает больших проблем при доступности матрицы в сухом виде, достоверность результатов нельзя гарантировать, если аликвота отбирается из концентрированной суспензии аффинной матрицы. Этой трудности иногда можно избежать, применяя рециркулирующую методику распределительного равновесия [18, 31], при которой жидкая фаза перемешиваемой суспензии аффинной матрицы и распределяющегося растворенного вещества анализируется спектрофотомет-рически при помощи проточной кюветы, помещенной в линию возвращения жидкой фазы в суспензию (рис. 2). Поэтому всю серию экспериментов по распределению можно провести с одной
202
Глава 6
и той же навеской сорбента, лишь несколько раз добавляя концентрированный раствор вещества к суспензии и поддерживая соответствующее значение сА после каждого добавления. Дополнительным преимуществом рециркулирующей распределительной методики является возможность установления момента достижения равновесия в системе, как только непрерывно измеряемое поглощение жидкой фазы достигнет постоянного значения.
3.3. Проблема определения концентрации свободного лиганда
В количественные выражения для аффинной хроматографии (табл. 1 и 2) входит концентрация свободного лиганда mSl которая совпадает с полной концентрацией лиганда т$ в смеси растворенного вещества и лиганда только в случае, когда S не взаимодействует с А или если тй>тл- Первоначально [3] Ms рассматривалась как наиболее доступная экспериментальная величина, и поэтому в графиках для количественного анализа моновалентных растворенных веществ в качестве концентрации лиганда чаще всего использовали значение ms, а не т3. Однако поскольку в этом случае графики были нелинейны (примеры 1 и 3), то необходимо будет выполнять такие нежелательные построения, как проведение касательных в точках l/ms-^-O. Далее, теоретически [17—19] вполне вероятно, что отклонение от линейности может быть обусловлено мультивалептностью растворенного вещества, вследствие чего применение касательных для расчетов оказывается неправильным подходом. Поскольку величины, полученные с использованием ms, нельзя считать достоверными, то надо определить ms в смеси растворенное вещество— лиганд.
При изучении взаимодействий белок — лиганд методом аффинной хроматографии концентрация белка тА составляет обычно <20 мкмоль (для белка с молекулярной массой 5000— 1 мг/мл). Соответственно для исследований, требующих более милимолярной суммарной концентрации лиганда, использование ms вместо ms в выражениях, приведенных в табл. 1 к 2, не приводит к ошибке, поскольку соблюдается требование >/7гА. Однако, если ms и тА имеют сравнимые значения, необходимо различать параметры ms и ms и использовать последний параметр для количественной оценки аффинной хроматографии.
Хотя, вообще говоря, можно ставить несколько хроматогра-фических экспериментов, основанных на параметрах тх, ?Ах, kA$ и т. д., полученных с использованием ms вместо ms [6], гораздо более просто для определения ms использовать исчерпывающий диализ растворенного вещества (белка) против раствора лиганда известной концентрации и применять продукт диффузии для предварительного уравновешивания аффинной матрицы. Отсутствие возможности последующего определения ms
