Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
Повторный анализ экспериментальных данных для системы альдолаза — фосфоцеллюлоза с помощью уравнения (4) при f=2 приводит к следующим значениям V^mx= 124(+15) нмоль и aax= 1,8(±0,5) ¦ 105 M"1. Однако этот анализ менее приемлем с той точки зрения, что значение Wmx, рассчитанное подобным образом, не всегда согласуется с тем, которое получено методом экстраполяции, и не зависит от f (рис. 4,а). Кроме того, относительная ошибка, связанная с определением йАХ, составляет 30%, т. е. в 2 раза больше, чем при нахождении kAx по рис. 4,6
Характеристика взаимодействий
211
при / — 4; эти данные также свидетельствуют в пользу более высокого значения валентности растворенного вещества. Действительно, метод оценки параметров путем минимизации стандартных ошибок позволяет предложить третий путь определения Шх
и &ах.
5.4. Определение тх и &Ах методом минимизации стандартных ошибок
Третий метод определения Шх был предложен [32] для анализа данных фронтальной хроматографии [20], основанной на взаимодействии лактатдегщцюгеназы с 10-карбоксидециламино-сефарозой. Для получения тх исследования при нескольких концентрациях фермента в этой системе [20] оказались недостаточными для точного установления величины отрезка, отсекаемого на оси ординат, на графике в обратных координатах (рис. 5, а) [18]. Однако для определения &ах по каждой из шести экспериментальных точек для ряда значений тх может
1/етдмкМ"1 тх(мкмоль/л)
Рис. 5. Определение концентрации доступных положений связывания матрицы (тх) из данных по изучению взаимодействий лактатдегидрогеназы-печени крысы с 10-карбоксидециламино-сефарозой методом фронтальной хроматографии [20]. а — график в обратных координатах [20, рис. 2] для определения Шх как обратной величины отсекаемого отрезка на оси ординат [18]; б — определение тх по тем же данным методом, основанным на минимизации относительной ошибки &Ах, рассчитанных при заданных значениях тх [32].
212
Глава 6
быть использовано соответствующее уравнение из табл. 2 (пример 3, Ws = O)1 после чего определяют значение, дающее наименьшую стандартную ошибку для средней величины kAX. Для случая, изображенного на рис. 5,6, при / = 4_было получено тх = 91 мкмоль/л и /еАх = 1,8-104 M"1; при / = 2т~х = 46 мкмоль/л, но степень относительной ошибки в &Ах (6,8%) была больше, что указывает на лучшее соответствие результатов при рассмотрении распределяющего фермента как тетравалентного вещества (/ = 4). Таким образом, методика, основанная на минимизации ошибок, также открывает возможности количественной оценки результатов аффинной хроматографии для получения достоверного значения тх.
5.5. Системы с лигандзадерживаемым элюированием растворенного вещества
Одним из возможных методов для определения тх в указанных системах является фактически описанная выше вторая методика, примененная к данным, полученным для ряда значений т\ в присутствии определенной концентрации лиганда ms; путем соответствующих преобразований уравнений, приведенных в табл. 2, можно получить
H-(^a)1//L kBmskjmx {V*aIVa)ij! J+V"s
?BmskT [1 - (V*A/VA)Vf] {VaIVa) mA (5)
1 + kBms
где kB и kr — соответствующие константы равновесия для образования двойных и тройных комплексов, аналогичные рассмотренным выше для моновалентных растворенных веществ. Независимо от выбора ms отношение тангенса угла^ наклона к ^ели-чнне отсекаемого отрезка графика [1 — (Va*/Va)Uf]/{VA*/VA)l/f от [I—(Va*/Va) Uf] (Уа/Уа*)гпа дает возможность определения mx- Кроме того, если концентрация лиганда достаточно высока, т. е. ?sms>l, то значение истинной константы ассоциации образования тройного комплекса может быть получено по тангенсу угла наклона графика. Как было отмечено в случае моновалентных веществ, условие {квт$^$>\) делает выражение для лигандзадерживаемой аффинной хроматографии в присутствии лиганда формально идентичным с выражением для лигандуско-ряемого элюирования в отсутствие лиганда (табл. 2), причем единственным отличием является замена константы тройного равновесия (?asx или ?xsa) на константу двойного равновесия &ах- Таким образом, все три описанных выше метода в принципе применимы к результатам, полученным для лигандзадержи-ваемых аффинных систем в присутствии насыщающей концен-
Характеристика взаимодействий
213
трации лиганда. Как отмечалось ранее, экспериментальные исследования, подтверждающие это заключение, в настоящее время отсутствуют.
5.6. Определение второй константы равновесия
Из четырех параметров, значения которых выводятся в количественной аффинной хроматографии (/, тх и две константы равновесия), валентность растворенного вещества и одна константа равновесия устанавливаются в ходе определения тх. Следовательно, остается единственная проблема определения значения другой истинной константы ассоциации, что представляет собой относительно простую задачу. Независимо от рассматриваемого конкретного случая (примеры 1—4) необходимые экспериментальные данные должны включать (Va*/Fa) или (гпа/гпа) для реакционных смесей, содержащих различные концентрации лиганда ms. При фронтальной хроматографии, например, можно ограничиться определением Fa как функции ms в экспериментах с определенным значением ша [20, 32], в то время как при использовании методики рециркулирующего распределительного равновесия [18] более удобно исследовать ряд концентраций растворенного вещества при нескольких концентрациях лиганда. В табл. 3 приведены некоторые результаты для системы альдолаза — фосфоцеллюлоза в присутствии фосфата [18], а также значение ?As для каждого эксперимента, полученное с применением уравнения из табл. 2 (пример 3). На основании данных табл. 3 можно заключить [18], что фосфат-зависимое элюирование альдолазы мышц кролика с фосфоцел-люлозы отражает конкуренцию между фосфатом и связывающими положениями матрицы за четыре эквивалентных и независимых положения альдолазы, причем при pH 7,4 и 7=0,15 ?АХ = 5,Ы04 M-1 и AAs = 350 M"1.
