Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
15—139
218
Глава 7
ных инструментов, что способствует правильному выбору матрицы как компонента биоспецифического взаимодействия.
Методика зонального элюирования в аналитической аффинной хроматографии была разработана фактически параллельно с методикой постоянного элюирования/фронтального анализа (гл. 6). Благодаря прежде всего экспериментальной простоте, зональный метод нашел широкое применение для биохимического анализа биомолекулярных взаимодействий, при которых одно из реагирующих веществ может быть иммобилизовано с сохранением способности биоспецифического связывания. Поскольку метод может быть использован для анализа очень небольших количеств подвижного компонента, он имеет важное значение
Рис. 1. Схематическое изображение различия в узнавании биоспецифического компонента подвижной фазы поверхностью аффинной матрицы. Аффинная матрица с такого рода биоспецифичностью может быть использована для аналитического изучения количественных параметров взаимодействия между подвижными и иммобилизованными компонентами и между ними и подвижными эффекторами.
как микрометод для биохимического анализа многих биологичек ски активных веществ, доступных только в небольших количествах (например, иммунореактивные или радиоактивно меченные вещества).
Ниже рассмотрены основные экспериментальные особенности и подходы аналитической аффинной хроматографии с зональным элюированием. Обсуждаются свойства аффинной матрицы и растворенного реагирующего вещества в отношении их применимости для аналитических (в отличие от препаративных) экспериментов. В заключение представлены примеры, показывающие возможности рассматриваемого метода для изучения нескольких систем, относящихся к взаимодействию белок — лиганд и белок— белок.
2. ЗОНАЛЬНОЕ ЭЛЮИРОВАНИЕ В АНАЛИТИЧЕСКОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Ниже приведено описание общей методики аффинной хроматографии взаимодействующего растворенного компонента на матрице с иммобилизованным биоспецифическим лигандом при зональном элюировании.
1) На колонку наносят зону небольшого объема, содержащую подвижный компонент; колонку предварительно уравнове-
Количественная аффинная хроматография
219
шивают соответствующим буфером, содержащим или не содержащим эффектор.
2) Элюирование продолжают уравновешивающим буфером ( + /— эффектор).
3) Определяют кривую элюирования первоначально введенного подвижного компонента.
Типы взаимодействий, которые могут иметь место в процессе аффинной хроматографии, если эффектор является конкурент-
Рис. 2. Схематическая диаграмма аффинной хроматографии с конкурентным зональным элюированием, изображающая взаимодействия подвижных и иммобилизованных компонентов. В приведенном примере элюирующий буфер содержит растворимый лиганд, конкурирующий с иммобилизованным лигандом за связывание с тем же активным положением подвижного компонента (в данном случае белка) [3].
ным лигандом, показаны на рис. 2; типичные результаты представлены на рис. 3.
Ниже рассмотрены общие методологические особенности аффинной хроматографии с зональным элюированием.
1) Зональное элюирование обычно проводят на небольших колонках объемом, как правило, 1—10 мл с узким внутренним диаметром (7—10 мм).
2) После упаковки адсорбента колонку уравновешивают буфером, используемым для хроматографического элюирования. Температура процесса зависит главным образом от стабильности компонентов биоспецифической системы и природы некова-лентных взаимодействий между подвижным и иммобилизованным компонентами.
3) В оптимальных условиях ряд физических параметров колонки, например скорость потока V0 (объем элюирования не взаимодействующего, проникающего в поры адсорбента вещества, размер молекул которого близок таковому для растворенно-
15*
220
Глава 7
45 р
Номер фракции
Рис. 3. Примеры кривых конкурентного зонального элюирования в ряде экспериментов с системой нейрофизин — пептид, показывающих хроматографическое поведение зон белка, элюированных с иммобилизованного лиганда 1 увеличивающимися количествами конкурентного лиганда в элюирующем буфере. Зоны (каждая по 100 мкл на 2 мл адсорбента) [1251]-меченного бычьего нейрофизина II элюировали с Met-Tyr-Phe-аминобутил-агарозы 0,4 M ацетатом аммония (pH 5,7), содержащим конкурентный лиганд лизинвазо-прессин при различных концентрациях. Увеличение концентрации растворенного конкурирующего лиганда приводит к пропорциональному уменьшению объемов элюирования меченого белка [4].
го компонента взамодействующей системы) и Vm (исключающийся объем), остается постоянным для серии экспериментов с зональным элюированием. Это дает возможность сравнивать результаты большого количества хроматографических анализов и исключает необходимость повторного определения Vo И Vm* Как правило, элюирование в небольших аналитических колонках осуществляют гравитационным методом; таким образом, скорость потока определяется гидростатическим давлением в колонке. Приемлемые скорости потока составляют 20—60 мл/ч.
4) TZ0 и Vm зависят от объема матрицы в колонке, однако при определении этих параметров обычно включают также объем внутри трубок, соединяющих колонку с коллектором фракций или с детектором, если он расположен между колонкой и коллектором. После определения V0 и Vm для данной системы
