Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
5.2.3. Другие методики. Когда определение ферментативной активности или прямые измерения радиоактивности не подходят для контроля элюирования, следует рассмотреть другие возможности для анализа связывания. Наибольшего внимания в качестве общего чувствительного метода количественного измерения подвижного компонента заслуживает, по-видимому, радиоиммуноанализ. Кроме того, может оказаться целесообразным измерение количества элюированного подвижного компонента с помощью количественного лигандсвязывающего анализа, например в случае доступности радиоактивно меченного лиганда, аналогичного по структуре иммобилизованному лиганду,
Количественная аффинная хроматография
233
6. ПРИМЕРЫ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИТИЧЕСКОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЗОНАЛЬНЫМ ЭЛЮИРОВАНИЕМ
С использованием количественной аффинной хроматографии с зональным элюированием был изучен ряд взаимодействующих систем белок — лиганд и белок — белок. Ниже приведены несколько типичных примеров, показывающих обычные хромато-графические результаты, получаемые при изучении моновалентных (например, нуклеаза стафилококков — нуклеотид), бивалентных (например, TEPC 15IgA бивалентный мономер — фос-форилхолин) и кооперативных (например, БФН-П — пептидный гормон) взаимодействующих систем.
Ш 20 30 40 50 60 70 Номер фракции
Рис. 4. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с моновалентным связыванием. Зоны, содержащие равные количества нуклеазы стафилококков, наносили на колонку с pdTpAP-сефа-розой (0,9-15 см, [L]=0,05 ммоль/л), уравновешенную 0,1 M ацетатом аммония (pH 5,7), содержащим растворимый конкурентный лиганд pdTpAP в концентрации (моль/л): / — 0,5-10-5; 2 — 0,785-10~5; 3 — 1,0-10'5; 4 — 2-Ю-5; 5 — 3-Ю-5; 6 — 4,0¦1O-5; для элюирования использовали те же буферы. Элюирование осуществляли при комнатной температуре. В правом верхнем углу по основным данным (и дополнительно для концентрации [pdTpAP] 5-Ю-5) построена зависимость 1/(V-V0) от [pdTpAP]. Из этого графика с использованием уравнения (2) (см. разд. 3.1) рассчитаны константы диссоциации Kl и Kt, приведенные в табл. 1 [3].
16—139
234
Глава 7
Таблица 1. Характеристика аффинных матриц, анализ кривых при количественной аффинной хроматографии
Подвижный компонент Количество подвижного компонента в нанесенной зоне, мкг Аффинная матрица [Li, моль/л Метод определения [LI
Нуклеаза стафилококков 200 PdTpAP-сефароза 5-Ю-5 Функциональная емкость
{14C]IgA бивалентный мономер6 25 Фосфорилхолин-сефароза 5-Ю-5 9-Ю"6 >
I3H]IgA моновалентный FabB (125I] БНФ-ПГ 0,04 <1 Met-Tyr-Phe-ами-ногексил-агароза 5-Ю-5 9-Ю-6 5,9- Ю-4 Аминокислотный анализ
101 Met-Tyr-Phe-ами-ногексил-агароза 5,9-10-* >
<1 БНФ-И-сефароза ью-4 >
а Все приведенные эффекторы — конкурентные лиганды за исключением лизинвазо dTpNp — дезокситимидин-З'-л-нитрофеннлфосфат; pdTpAP — дезокситимидин-5'-фосфат-3'-* TEPC 15. IgA, восстановленный в мягких условиях и алкилированный [14C] иодо-в Fab-фрагменты, полученные из TEPC 15 IgA мономеров ограниченным протеолизом г БНФ-П после реакции с реагентом Болтона — Хантера, меченного 125I.
6.1. Связывание нуклеазы стафилококков с иммобилизованными нуклеотидами
На рис. 4 представлены результаты, полученные при элюи-ровании зон нуклеазы стафилококков с pdfpAp-сефарозы при различных концентрациях растворимого конкурентного лиганда [3]. Линейность зависимости Ij(V—Vo) от [L] отражает 1 : 1-природу взаимодействия фермент — нуклеотид; эта зависимость может быть использована для расчета констант диссоциации /Cl и Kl с использованием моновалентных моделей [уравнение (2)]. Рассчитанные константы приведены в табл. 1; там же приведены результаты для двух других конкурентных лигандов.
Количественная аффинная хроматография
235
элюирования, методы расчета и значения констант, полученные с зональным элюированнем
Эффектор а Метод детектирования элюированного подвижного компонента Модель для расчета моль/л «г. моль/л Литература
PdTpAP Определение фермен- Уравнение (2) 2,3-Ю-6 1,Ы0-в 3
тативной активно-
сти
PdTp То же 2,5-10-« I1O- ю-6 3
dTpNP » » 4,3-Ю-3 1,5- Ю-6 3
Фосфорилхо- Определение радио- Уравнение (5) 1,7-Ю-6 2,7-Ю-6 9
лин активности на сцин- » 1,6-ю-6 4,8-Ю-6
тилляционном счет- Уравнение (2) 1,2- Ю-6 1,2- Ю-6 9
чике
То же » 3,3-10"6 4,2-Ю-6 9
1,5-Ю-6 3,9- Ю-6 9
Окситоцин Детектор ^-измерения 6,6-ю-5 4,7-Ю-5 ( ппи 4
[L]^O)
То же Уравнение (3) — 4,8-Ю-5 4
.(при
[L]=O)
> Уравнение (2) 1,8-10"6 7,0-10-7 4
(при
[L]^O
— Уравнение (3) — 6,1-ю-6 4
при
M=O)
Нет — 1,4- Ю-5 21
Лизинвазопрес- — 4,4-10-7 21
син
(1 • Ю-* моль/л)
прессина, являющегося достоверным эффектором; pdTp ~ 3',5'-дезокситимидиндифосфат;.
л-аминофенилфосфат.
ацетамидом.
папаином белка, тритиированного восстановительным метилированием.
Таким образом, этим методом можно устанавливать сразу несколько констант равновесного связывания для ряда конкурирующих лигандов и благодаря этому оценивать специфичность взаимодействия.
