Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
5.L2. Восстановительное алкилирование. Тритиированные IgA-антитела могут быть получены восстановительным метилированием мономерного IgA [9]. Для этого мономерный IgA растворяют в 0,2 M борате (pH 8,3; 2 мг восстановленного и ал-килированного IgA на 2 мл буфера). К раствору добавляют 40 мКи [3Н]борогидрида натрия (10 Ки/ммоль, поставляется фирмой New England Nuclear Inc.). Для осуществления реакции метилирования добавляют 20 мкл формальдегида в виде 0,4%-ного раствора (при охлаждении льдом продолжительность реакции 10 мин). По окончании реакции непрореагировавшие реагенты удаляются путем гель-фильтрации, а затем проводят диализ меченного тритием белка против NaCl-натрийфосфатно-го буфера (pH 7,4). Удельная активность [3H] белка, приготовленного при соблюдении описанных выше количественных соотношений (использован для экспериментов, приведенных в разд. 6.2), составляет —0,5 мкКи/мкг.
5.1.3. Карбамилирование. Меченный углеродом-14 бычий нейро-физин I ([14C]бнф-і) получен [22] карбамилированием натив-
Количественная аффинная хроматография
231
ного БНФ-І с 14С-меченным цианатом калия (KCNO, удельная активность 6,2 мКи/ммоль). Для этого БНФ-І (12 мг) растворяют в 0,5 M борате (pH 8,5; 0,75 мл) и обрабатывают 12 мг [14С]меченного KCNO в течение 15 ч при комнатной температуре. По окончании реакции раствор подкисляют до pH 7,4 путем добавления ледяной уксусной кислоты; смесь фракционируют путем гель-фильтрации (сефадекс G-50, 0,9x58 см, уравновешен NaCl-натрийфосфатным буфером, pH 7,4). Удельная активность полученного таким образом меченого БНФ-І составляет — 1 нКи/мкг белка. Показано, что меченный подобным образом нейрофизин сохраняет способность биоспецифически связываться с лизинвазопрессин-сефарозой [22]; он был использован в аналитической аффинной хроматографии [20].
5.L4. Иодирование, 1251-Меченный БНФ-П может быть получен [4] по реакции с ї^-сукцинимидил-3-(4-гидрокси-5-[125I] иодофе-нил)пропионатом [23]. В типичном эксперименте добавляют аликвоту (20 мкл) БНФ-І или II (5 мг/мл в ацетате аммония, pH 5,7) и 40 мкл 1,0 M бората (pH 8,5) к высушенному реагенту Болтона — Хантера (1 мКи; 2000 Ки/моль, поставляется фирмой New England Nuclear). Через 15—30 мин при охлаждении льдом и эффективном перемешивании обрабатывают избыток реагента в течение 10—15 мин при охлаждении льдом с 300— 500 мкл 0,2 M глицина в 0,5 M борате (pH 8,5). После этого отделяют [125I] БНФ-І или II от реагентов путем хроматографии на сефадексе G-25 (PD-10, Pharmacia) в 0,2 M уксусной кислоте и после удаления кислоты проводят очистку путем препаративной аффинной хроматографии на Met-Tyr-Phe-аминогексил-агарозе [20]. Радиоактивно меченный материал в 0,4 M ацетате аммония (pH 5,7) специфически связывается с матрицей и элюи-руется 0,2 M уксусной кислотой; он может быть лиофилизован в присутствии кристаллического бычьего сывороточного альбумина. Для получения основного раствора высушенный меченый белок растворяют в 10 мМ фосфате (pH 7,4). Использованный в экспериментах, приведенных в разд. 6.3, препарат [125I] БНФ-П имел удельную активность, равную 2,5 мкКи/нмоль белка [4], в то время как препарат для экспериментов по элюированию, описанных в разд. 6.4,-0,3 мкКи/нмоль [21].
5.2. Контроль элюирования
5.2.1. Анализ ферментов. В исследованиях взаимодействий фермент— иммобилизованный ингибитор можно использовать ферментативную активность для контроля элюирования зоны фермента с матрицы. Преимуществом этого подхода является отсутствие необходимости ковалентной модификации образца. В то
232
Глава 7
же время, если проводятся конкурентные элюирования, фракции, содержащие элюированный фермент, могут нуждаться в предварительном разбавлении или диализе для уменьшения влияния растворимого конкурирующего лиганда на ферментативную активность.
5.2.2. Измерение радиоактивности. Радиоактивно меченные образцы могут быть определены с высокой чувствительностью. Так, когда контроль элюирования по другим характерным для данной молекулы активностям недостаточно чувствителен, введение радиоактивной метки (радиоактивного изотопа) дает возможность определения небольших количеств подвижного компонента, с которыми и имеют дело в аффинной хроматографии с зональным элюированием (см. разд. 2 или 3.1). Определение радиоактивности меченных образцов является прямым методом. При использовании углерода-14 и трития в качестве радиоактивных меток измерение радиоактивности проводят на сцинтилля-ционном счетчике; измеряемые образцы готовят путем смешивания определенной аликвоты жидкого сцинтиллятора с соответствующим количеством (для достижения равного гашения компонентами буфера) каждой фракции элюата. Введение в хро-матографическую систему сцинтилляционного счетчика дает возможность исключить необходимость отбора образцов, хотя по крайней мере для существующих приборов чувствительность детектирования при этом уменьшается.
[125I]-меченные образцы дают возможность наиболее удобно контролировать процесс элюирования при высокой чувствительности детектирования. Фракции элюата могут сразу поступать в автоматический гамма-счетчик. В этом случае благодаря простоте работы с образцами и легкости получения данных исследователь может снимать большое количество кривых элюирования с колонки за короткое время. Образцы, меченные иодом-125 с умеренной удельной активностью (5—500 нКи/мкг), можно детектировать просто и надежно при нанесении в субмикрограм-мовых количествах.
