Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Химия -> Аберкромби Д. -> "Аффинная хроматография" -> 86

Аффинная хроматография - Аберкромби Д.

Аберкромби Д., Алленмарк С, Арамэ С, Бара-бино Р. Аффинная хроматография — М.:Мир, 1988. — 278 c.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка): affinnayahromotograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 106 >> Следующая

Количественная аффинная хроматография
227
Функциональная емкость упакованной колонки с замещенным твердым носителем может быть определена путем насыщения упакованной колонки подвижным связывающимся компонентом. На определенный объем матрицы наносится избыток растворенного компонента по отношению к теоретической емкости модифицированного носителя [13]. Матрица промывается уравновешивающим буфером до отсутствия в элюате связывающегося вещества. Затем связавшееся вещество элюируют и определяют его количество. Если насыщение матрицы нецелесообразно (например, ввиду низкого сродства матрицы к подвижному компоненту), связывающаяся емкость может быть измерена с помощью бетч-метода, при котором небольшие объемы аффинной матрицы смешиваются с различными концентрациями подвижного компонента с последующим определением количества связавшегося компонента при каждой концентрации и экстраполяцией полученных данных к насыщению. Это позволяет установить полное количество подвижного компонента, связывающегося с матрицей при насыщении, без действительного насыщения матрицы.
Полное количество иммобилизованного компонента может быть определено двумя путями. Первый заключается в непосредственном анализе твердого носителя. Для пептидов и белков использовали аминокислотный анализ после исчерпывающего кислотного гидролиза (6,0 M HCl, HO0C, 24 ч, вакуум) (см., например, работу [4]). Для матриц, содержащих иммобилизованные нуклеотиды, проводилось определение фосфата [14] после исчерпывающего гидролиза модифицированной матрицы [15]. Другой метод состоит в определении после реакции присоединения количества лиганда, не связавшегося с твердым носителем. Количество иммобилизованного лиганда определяется вычитанием количества лиганда, остающегося в растворе после реакции (включая промывные воды), от исходного количества лиганда.
4.3. Примеры получения аффинных матриц
4.3.L pdTp-аминофенил-сефароза. Нуклеаза стафилококков, полученная из Staphylococcus aureus, гидролизует PHK и ДНК. Тимидин-3',5',-Дифосфат (pdTp)—сильный ингибитор этого фермента; поэтому он был выбран в качестве лиганда для присоединения к сефарозе с целью аффинной хроматографии этого фермента [16]. pdTp-аминофенил-сефарозу получают в результате одностадийной реакции конденсации бромоцианактивированной сефарозы с 3'-(4-аминофенилфосфорил)-дезокситимидин-5'-фосфатом (pdTpAP).
1) Бромоцианактивированную сефарозу, которую можно приготовить (см. гл. 2 разд. 1 и работу [17]) или использовать в виде продажного препарата, промывают 0,1 M бикарбонатным буфером (pH 9) и суспендируют в равном объеме того же буфера.
2) Добавляют лиганд pdTpAP в растворе, составляющем ~5—15% конечного объема.
28
Глава 7
3) Суспензию осторожно перемешивают (чтобы не повредить шарики сефарозы) при 4 °С в течение 24 ч и затем тщательно промывают водой и буфером.
Установлено, что при использовании в реакции иммобилизации 2,5 и 0,5 мкмоль растворимого лиганда на 1 мл сефарозы количество лиганда, присоединенного к бромоцианактивированной сефарозе в описанных выше условиях, в одном случае составляло 1,5 и 0,3 мкмоль/мл сефарозы [16]. Емкость приготовленного сорбента устанавливалась путем насыщения известного количества иммобилизованного лиганда чистой нуклеазой стафилококков. Связанный белок элюировали и определяли его количество по ферментативной активности. С матрицами, содержащими 1,5 и 0,3 мкмоль лиган-да/мл сефарозы, связывалось 8 и 1,2 мг нуклеазы/мл сефарозы. Зная содержание фосфата в сорбентах и принимая, что фермент связывается с иммобилизованным лигандом в молярном соотношении 1 : 1 [16], можно рассчитать, что максимальное теоретическое связывание фермента с сорбентом составляет 28 и 6 мг/мл соответственно. При аналитическом элюировании с pdTpAP-сефарозы, описанном в разд. 6.1, [L]=0,05 ммоль/л (функциональная емкость сорбента), а при расчете по содержанию фосфата эта величина составляет 0,21 ммоль/л.
4.3.2. Фосфорилхолин-сефароза. Известно, что бивалентные IgA-антитела (TEPC 15), выделенные из BALB/c мышиной гамма-А-миеломы, специфически связываются с фосфорилхолином. Фосфорилхолин, присоединенный к сефарозе, успешно использован в качестве аффинной матрицы как в препаративной [18], так и в количественной аффинной хроматографии [9]. Аффинная матрица была получена в две стадии [18]. На первой стадии глицил-тирозин присоединяли к CNBr-активированной сефарозе через а-аминогруп-пу глицина; вторая стадия — реакция замещения, при которой диазогруппа л-диазонийфенилфосфорилхолина атакует орго-положение по отношению к гидроксильной группе фенольного кольца связанного с матрицей глицилти-розина. Для аналитических целей эта замещенная матрица может быть получена путем взаимодействия определенного количества CNBr-активированной сефарозы (10 мл влажного сорбента) с 35 мкмоль глицил-тирозина [9]. Получение CNBr-активированной сефарозы и последующую реакцию с глицилтирозином проводят в соответствии с опубликованными методиками [17]. После первой реакции иммобилизации замещенный гель промывают боратным солевым буфером (pH 8,0), затем суспендируют в том же буфере и обрабатывают 5 мкмоль л-диазонийфенилфосфорилхолина. Перемешивают эту смесь при комнатной температуре в течение ночи. По окончании реакции замещенный гель промывают водой и хранят в 1,0 M уксусной кислоте при 4 0C
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 106 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed